乙螨唑对斑马鱼的急性毒性与生物富集效应*

谭正莹，龚会琴，尹君静，廖朝选，包 娜

(贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550014)

螨类害虫是果园中主要的害虫，其繁殖力强，隐蔽性高，危害性大，人们为了保障果园的生产，使用了大量的杀螨农药，但同时也产生了严重的环境问题[1]。环境风险评估是指导农药科学使用的重要利器，对保障生态环境可持续发展意义重大。杀螨农药在果园中施用后，漂移至地面或在叶片上残留的农药可能随雨水冲刷、土壤淋溶等进入水体，可能造成水生态系统的破坏。鱼类作为水生态系统中处于食物链上层的主要生物，研究其急性毒性和生物富集效应可为风险评估提供重要的数据。

乙螨唑(Etoxazole)是2，4-二苯基噁唑衍生物类化合物，可抑制螨卵的胚胎形成以及从幼螨到成螨的蜕皮过程，对螨类害虫从卵、幼虫到蛹都具有优异的触杀作用[2]。当前有效登记的乙螨唑产品有141个，主要用于柑橘、苹果等果树上红蜘蛛(Tetranychuscinnbarinus)等螨类的防治[3]，其大量的登记使用，对环境可能产生的风险不容忽视。研究表明，乙螨唑可引起斑马鱼的卵黄囊和心脏水肿，活力丧失、心率异常和发育不全，并可诱导细胞凋亡以及体内富集[4-5]。也有研究表明，在推荐田间用药量下，乙螨唑会严重影响加州新小绥螨的卵孵化率[6]。本研究通过乙螨唑原药对斑马鱼的急性毒性和生物富集效应，可为全面评价乙螨唑在环境中的风险提供科学数据，指导农药安全使用。

1 材料与方法

1.1 试验生物

斑马鱼(Daniorerio)：幼鱼购自上海宏业观赏鱼养殖场，置于实验室内持续饲喂直至试验前1 d。试验鱼健康无病，试验前7 d死亡率低于5%，体重0.25～0.30 g。

1.2 试剂与溶液

乙螨唑标样(99.0%，国家农药质量监督检验中心)；乙螨唑样品(96%，来自贵州省分析测试研究院)；乙腈(色谱纯，Merck KGaA)；甲酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；碳酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；曝气生态水：经活性炭与曝气脱氯48 h的自来水，溶解氧约101%ASV，硬度190 mg/L(以CaCO3计)，pH值约8.0。

1.3 仪器

Agilent 1290/6470A液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(美国Agilent公司)；ZD-85A气浴恒温振荡器(上海比朗仪器有限公司)；HQ30D溶解氧测定仪(美国哈希公司)，LD5-10离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)，FE20K酸度计(梅特勒-托利多(中国)有限公司)，YD300硬度计(上海三信仪表厂)，AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，0.0001 g)，DT500A电子天平(常熟意欧仪表有限公司，0.01 g)，移液器(Eppendorf，100～1000 μL)；SK250H超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)。

1.4 试验方法

1.4.1 急性毒性试验

试验参考GB/T31270.12—2014《化学农药环境安全评价试验准则》第12部分：鱼类急性毒性试验，采用静态试验法测定了96%乙螨唑原药对斑马鱼的急性毒性。以丙酮作为助溶剂(最高浓度为0.1 mL/L)，用曝气生态水设置了0.903 mg/L、1.10 mg/L、1.34 mg/L、1.64 mg/L、2.00 mg/L浓度组，并设空白对照组和助溶剂对照组进行试验暴露。为减少生物使用，试验不设平行，每组制备5 L药液，加入10尾鱼进行试验暴露。整个试验在23 ℃±2 ℃、16 h光照/8 h条件下进行，试验开始后每日观察并记录斑马鱼的中毒与死亡情况。为确保试验的有效性，每日测定试验溶液的温度、pH值和溶解氧，并在试验开始和结束时分别测定试验溶液浓度。

1.4.2 生物富集试验

生物富集试验是通过鱼类暴露于一定浓度的农药中，在8 d的时间内持续采样分析，通过鱼体内农药含量与水中浓度对比确定富集系数，评估其富集程度。主要的研究方法有静态试验法、半静态试验法和流水式试验法，主要通过农药在水中的稳定性(≥80%初始浓度)确定，试验的浓度常结合农药对鱼类的急性毒性，取96 h-LC50的1/10和1/100两个质量浓度用于暴露。设定了0.0155 mg/L和0.155 mg/L两个浓度组，以及空白对照组和助溶剂对照组，采用半静态试验法进行试验暴露，换液周期为48 h。

准确称取0.0105 g 96%乙螨唑原药于称量瓶中，用丙酮溶解并完全转移至10 mL容量瓶中定容至刻度，得到1.0 mg/mL的母液。分别取465 μL、4.65 mL加入30 L暴露试验用水中，以2500 r/min搅拌20 min后制备得0.0155 mg/L和0.155 mg/L的暴露试验药液，然后加入50尾鱼用于试验。试验各组均设2个重复，于23 ℃±2 ℃、16h光照/8 h条件下进行。试验开始后每日喂食0.14 g，喂食完毕后采用50 mL移液管将容器底部的粪便、食物残渣等清理干净，并在试验开始后0 h、12 h、24 h、48 h、96 h、144 h、196 h定期采集鱼样和水样，测定乙螨唑浓度。

1.4.3 分析方法

结合王蒙岑[7]、何智宇[8]建立的乙螨唑分析方法，优化流动相及色谱条件，确定仪器分析方法。液相色谱分析条件：色谱柱为Agilent Extend-C18(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)、柱温为30 ℃、流动相采用0.1%甲酸水/乙腈(V/V=40∶60)、进样体积5 μL、流速0.3 mL/min、运行时间：6 min。质谱条件为ESI+模式，MRM扫描，温度(300 ℃)，Fragment(118 V)，定性/定量离子对(304.1/117，304.1/140.9)。

1.4.4 样品前处理

水样：使用移液管从试验缸的中部取试验液5 mL，高浓度组药液用曝气生态水进行10倍稀释，然后经0.22 μm水系滤膜过滤后待测。

鱼样：取7尾试验鱼于烧杯中，用去离子水清洗表面，然后用滤纸吸干水分，再使用剪刀割剪断脊柱使其死亡，称重后置于研钵中。加入2 g NaCO3进行研磨，研细后使用25 mL乙腈转移至250 mL具塞三角瓶中超声20 min，恒温(20 ℃±2 ℃)振荡提取1 h，离心5 min(4000 r/min)，稀释一定倍数后取上清液经0.22 μm有机滤膜过滤后待测。

1.4.5 数据处理

鱼类急性毒性试验的96 h的LC50值与95%置信限采用SPSS19.0进行Probit回归分析。斑马鱼对乙螨唑的富集系数(BCF)，通过公式BCF=Cfs/Cws计算，式中：BCF为生物富集系数；Cfs为平衡时鱼体内的农药含量(mg/kg)，Cws为平衡时水体中的农药含量(mg/L)。依据《化学农药环境安全评价试验准则》中的分级标准，对乙螨唑对斑马鱼的急性毒性和生物富集性进行判定。

2 结果与分析

2.1 分析方法

2.1.1 标准曲线的绘制

用乙腈配制1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L和100.0 μg/L的乙螨唑系列工作溶液，在上述液相色谱和质谱条件下分析，将浓度(X)与峰面积(Y)进行线性拟合，其回归方程为：

y=25757.20x+2399.465

相关系数R2=0.99998。结果表明，乙螨唑在1.0～100.0 μg/L浓度范围内线性良好。

2.1.2 添加回收率试验

水样添加回收率测定： 分别取100.0 μg/L的工作溶液0.10 mL、1.0 mL于10 mL容量瓶中，用曝气生态水制备为1.0 μg/L和 10.0 μg/L的加标水样，每个浓度设置3个重复，然后按上述前处理与分析方法测定含量。该方法下，水中乙螨唑的回收率为 98.5% ～103.1%，最低检测浓度为1.0 μg/L。

鱼样添加回收率测定： 取2.00 g鱼浆，向其中添加0.025 μg、0.25 μg乙螨唑标准品，制备为0.0125 mg/kg、0.125 mg/kg的加标鱼样，每个浓度设置3个重复，然后按上述前处理与分析方法测定含量。该方法下，鱼样中乙螨唑的回收率为 92.0%～105.6%，最低检测浓度为0.0125 mg/kg。

2.2 乙螨唑对斑马鱼的急性毒性

试验期间溶液的温度为22.1～24.4 ℃，溶解氧为75.5%～102.7%ASV，pH值为7.72～8.22，满足环境条件要求。空白对照和助溶剂对照组中供试鱼均未发生死亡，死亡率低于10%，试验期间各组浓度保持在初始浓度的87.3%～101.2%范围，符合试验有效性规定。设定的浓度0.903 mg/L、1.10 mg/L、1.34 mg/L、1.64 mg/L、2.00 mg/L各组中，供试鱼在8 h后即发生快速游动、侧翻的中毒症状，24 h后出现平躺现象，伴随死亡发生，96 h后存活鱼出现游动迟缓、体色变深。

将试验浓度与斑马鱼死亡率经SPSS19.0统计分析，乙螨唑对斑马鱼的96 h-LC50=1.55 mg/L，95%置信限为1.39～1.75 mg/L。依据《化学农药环境安全评价试验准则》中对鱼类急性毒性的等级划分标准，乙螨唑对斑马鱼急性毒性的96 h-LC50介于1.0～10.0 mg/L之间，为“中毒”类农药。

2.3 乙螨唑在斑马鱼体内的生物富集性

半静态试验的结果显示，随暴露时间的增加，斑马鱼对乙螨唑的富集系数BCF逐渐增大，变化情况见图1。在0.0155 mg/L浓度中，BCF8d=4425 L/kg，在0.155 mg/L浓度下，BCF8d=3305 L/kg，详细结果见表1。依据《化学农药环境安全评价试验准则》中“农药生物富集等级划分”，乙螨唑的生物富集系数BCF8d>1000，为高富集性农药。

图1 生物富集系数随时间变化图Fig.1 Changes of bioconcentration factor with time

表1 乙螨唑的鱼类生物富集系数(BCF)Tab.1 The bioconcentration factor of etoxazole in fish

3 结论

对于微溶于水的农药，开展水生生物试验时常使用有机溶剂助溶，但使用助溶剂需确保不对试验产生影响。乙螨唑微溶于水，使用丙酮助溶后在水中分散更加快速、均匀，在急性毒性和生物富集试验的助溶剂对照组中斑马鱼均未发生死亡，表明其助溶效果好且对试验的影响较小。

农药对靶标生物具有良好活性，但同时对非靶标生物也有一定的药害，其环境安全问题一直受到广泛关注。急性毒性试验结果显示，乙螨唑对斑马鱼的急性毒性为“中等毒性”，是当前替代高毒、剧毒农药的主要类型。但乙螨唑容易在斑马鱼体内蓄积，具有“高富集性”，其对鱼类的长期危害需要特别注意。在田间应用时，应该严格控制其使用量与范围，以避免进入水体造成生态系统破坏。同时乙螨唑具有一个手性中心，存在两个降解、毒性均有一定差异的对映异构体，而且在土壤和蚯蚓体内均能产生具有一定持久性的代谢物M1(C21H21F2NO2)和M3(C21H21F2NO4)[9]。为了更加全面、准确地评价乙螨唑的环境风险，不同对映体以及代谢产物对非靶标生物的毒性影响以及环境归趋特征还需进一步研究。