生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠降血脂作用和胆汁酸代谢的影响

常 青，郑宝东,2，张 怡,2，曾红亮,2,*

（1.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2.福建省特种淀粉品质科学与加工技术重点实验室，福建 福州 350002）

生姜（Zingiber officinaleRoscoe），是姜科、姜属的多年生草本植物的新鲜根茎，是我国药食两用的特产经济作物，产量居全球首位[1]。生姜中淀粉质量占干质量的40%～70%，是生姜根茎中主要的碳水化合物。目前，生姜主要以鲜姜、干姜和姜粉为主，其深加工产品较少，研究主要集中于生姜小分子活性物质上，大量的淀粉在经过提取之后被丢弃，造成了资源的浪费[2]。前期研究表明，生姜淀粉颗粒呈三角形片状，与大宗淀粉颗粒存在明显的差异，为特异性的淀粉颗粒；而且生姜淀粉中天然抗性淀粉颗粒约占70%以上，其中直链淀粉占35%，加工过程中易老化生成III型抗性淀粉[3]。

抗性淀粉在小肠内不能被健康人体所利用，但能在大肠中被肠道微生物发酵或部分发酵代谢，产生短链脂肪酸、乳酸和其他少量气体[4]。抗性淀粉分为5大类，分别为I型物理包埋淀粉、II型天然抗性淀粉颗粒、III型回生淀粉、IV型化学改性淀粉和V型淀粉酯质复合物[5]。抗性淀粉作为一种新型的膳食纤维，以多种方式参与调控机体脂质代谢、胆固醇合成和分解、脂肪酸的摄入和氧化、胆汁酸的合成和代谢等生理过程，在维持或改善脂质代谢平衡、防止脂肪过度沉积中发挥着重要的作用[6-8]。胆汁酸是机体重要代谢信号分子，不仅能够参与机体营养物质的消化代谢，还能参与机体脂质、葡萄糖和能量平衡的调节[9]。胆汁酸可分为初级胆汁酸和次级胆汁酸，初级胆汁酸在肝脏中胆汁酸合成酶的催化下由胆固醇转化而来；次级胆汁酸是初级胆汁酸经胆囊分泌到肠道中，在肠道菌群的催化下经过修饰及转化等作用生成[10-11]。机体胆汁酸池的容量和组成变化会引起血清中胆汁酸代谢轮廓谱的变化，而血清胆汁酸的含量和组成可影响肝肠胆汁酸的循环[12]。

因此，本研究采用高脂饲料诱导SD大鼠形成高脂血症动物模型，以普通饲料为正常对照（normal control，NC），以辛伐他汀为阳性对照（positive control，PC），以高直链玉米淀粉（high amylose maize starch，HMS）为普通对照，采用灌胃方式，研究3种生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠生理指标的影响，分别测定大鼠摄食量，体质量增加量，大鼠血清中甘油三酯（total triglyeride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TCHO）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）及谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平等血脂指标；采用光学显微镜观察血管、结肠和肝脏等组织病理学特征，并测定结肠绒毛长度、黏膜厚度等肠道形态学指标。在此基础上，采用靶向代谢组学技术测定血清中25种初级和次级胆汁酸含量，构建血清胆汁酸代谢轮廓谱，以期为生姜抗性淀粉调控肠道菌群介导胆汁酸代谢机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级SD雄性大鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物编号：20170005031590，生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。

新鲜生姜 福建省三明市大田生姜专业合作社；动物饲料 闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司；辛伐他汀上海信谊万象药业股份有限公司；苏木素-伊红染液（hematoxylin-eosin staining，HE） 武汉谷歌生物科技有限公司；碳酸利多卡因注射液 四环药业股份有限公司；乙腈、甲醇 美国Fisher Scientific公司；其余试剂药品均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AU2700全自动生化分析仪 美国贝克曼库尔特有限公司；液相色谱-串联质谱联用仪 美国AB SCIEX公司；Viscotek TDA305max多检测器凝胶渗透色谱仪英国Malvern公司；病理切片机 上海徕卡仪器有限公司；组织摊片机 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗性淀粉的制备

生姜原淀粉、II型生姜抗性淀粉（ginger resistant starch type 2，GRS2）、III型生姜抗性淀粉（ginger resistant starch type 3，GRS3）、IV型生姜抗性淀粉（ginger resistant starch type 4，GRS4）的制备和纯化方法参考常青[13]的方法进行，获得的GRS2、GRS3和GRS4中抗性淀粉质量分数分别为（95.78±2.44）%、（95.36±2.16）%和（92.46±1.97）%。

1.3.2 饲料的制备

高脂饲料配方：89.25%（质量分数，下同）普通饲料、5.00%蛋黄粉、5.00%猪油、0.50%胆固醇和0.25%猪胆盐。普通饲料符合GB 14924.3—2010《实验动物 配合饲料营养成分》。

1.3.3 动物分组和给药方法

动物实验在福建中医药科学研究院比较医学中心SPF级动物实验室内开展，动物实验伦理审查编号：FJATCM-IAEC2020016。

动物分组和给药方法如下：雄性大鼠84只，适应性饲养1周，期间自由饮水饮食。按体质量随机分成2组，一组12只给予基础饲料，一组72只给予高脂饲料，喂养2周后，将基础饲料组分别淘汰体质量最高和最低的3只，剩余6只为NC组，继续喂养普通饲料4周，每日灌胃生理盐水2 mL/100 gmb。高脂饲料组喂养2周后，淘汰体质量较高的肥胖敏感大鼠18只和体质量较低的肥胖抵抗大鼠18只，剩余36只大鼠随机分为6组，每组6只。

高脂模型（hyperlipidemic model，HM）组：喂养高脂饲料4周，每日灌胃生理盐水2 mL/100 gmb。

PC组：继续高脂饲料喂养4周，同时给予4 mg/kg辛伐他汀（辛伐他汀10 mg/片，溶于50 mL蒸溜水中，得0.2 mg/mL悬液），灌胃剂量为2.0 mL/100 gmb，每日1次，共喂养4周。

GRS2、GRS3、GRS4、HMS组：继续高脂饲料喂养4周，同时分别灌胃GRS2、GRS3、GRS4、HMS淀粉悬浊液（0.125 g/mL），灌胃剂量为0.25 g/100 gmb，每日1次，共喂养4周。

淀粉灌胃剂量0.25 g/100 gmb是根据中国居民膳食指南中60 kg成人每日推荐膳食纤维摄入量20～35 g/d和其他抗性淀粉最佳剂量来确定的，如香蕉抗性淀粉等[14]。

1.3.4 体质量和脏器指数的测定

在造模开始时（第1周）、给药前（第3周）和给药后（第7周），分别测定各组大鼠体质量。4周给药处理结束后，处死大鼠时，迅速分离肝脏、肾脏、脾脏、胸腺及心脏，用生理盐水漂洗后，再用滤纸吸干表面水分，称质量。脏器指数计算如公式（1）所示。

1.3.5 大鼠血脂指标的测定

各组大鼠喂养2周后，禁食12 h但不禁水，眼眶取血1 mL置于装有肝素钠的离心管中，血样送解放军四七六医院检验科测定血脂各项指标（包括TG、TCHO、HDL-C、LDL-C浓度）。实验期间，每日称体质量1次，调整给药量。第7周处死时，取腹主动脉血清0.5 mL置于离心管中，血液标本送解放军四七六医院检验科测定血脂指标。

1.3.6 血管病理学观察

取主动脉上端约1 cm，根据标准组织切片技术，固定于质量分数4%多聚甲醛中，主动脉组织固定7 d后，进行石蜡包埋，制作组织切片及HE染色，HE染色流程参照Zeng Hongliang等[15]的方法进行，用于血管病理学观察。

1.3.7 结肠组织病理学观察

制作结肠组织切片厚度为2～3 mm，将固定好的结肠组织用无菌水清洗后，分别经70%（体积分数，下同）、80%、90%、100%乙醇梯度脱水1 h，脱水后在乙醇和二甲苯混合液（1∶1，V/V）中浸泡40 min，再放置于二甲苯中浸泡40 min。待组织透明后立刻浸蜡，在52～54、54～56 ℃和56～58 ℃ 3种不同熔点的石蜡中各处理2 h。待蜡块接近凝固后放入水中加速凝固，修理、切片，约厚5～6 μm。结肠组织切片的染色和观察参照黄灿灿[16]的方法进行。

1.3.8 肝脏组织病理学观察

大鼠解剖取肝脏后，取面积约为0.5 cm厚度为4 μm的组织用生理盐水清洗干净，在清洗后用吸水纸将残留液擦干后，用质量分数4%多聚甲醛进行固定，密封过夜，然后经乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋、切片、贴片、HE染色和固封等处理后制作肝脏组织切片。光学显微镜下从低到高倍数进行肝脏组织病理学观察。

1.3.9 血清胆汁酸靶向代谢组学测定

1.3.9.1 胆汁酸标准液的配制

精确称取胆汁酸标准品1 mg，加甲醇溶解并定容至1 mL，漩涡混匀，即可得标准品储备溶液。

取上述标准品储备溶液各10 μL，加体积分数50%甲醇稀释至1 mL，得10 000 ng/mL工作液；再逐步稀释得标准品质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL工作液，装入1.5 mL的离心管中，待用。

采用液相色谱-串联质谱联用进行检测，具体参数如下：色谱条件：LC30A色谱仪，Waters BEH C18色谱柱（150 mm×2.1 mm、1.7 μm），柱温40 ℃，进样量为1 μL。流动相A（0.1%（体积分数，下同）甲酸-水溶液），流动相B（0.1%甲酸-乙腈）。质谱条件：QTRAP 6500+质谱仪，采用负离子模式检测，气帘气为35，喷撞气为中等强度，离子化电压为－4 500 V，温度为500，喷雾气为40，辅助加热气为50。标准品的总离子流图如图1所示。

图1 胆汁酸标准品总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatogram of bile acid standards

以目标标准溶液的色谱峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制线性回归标准曲线。标准曲线方程如表1所示，所有标准曲线方程的R2均大于0.99，说明方程线性良好。

表1 胆汁酸标准品的线性方程Table 1 Linear calibration equations for bile acid standards

1.3.9.2 液相色谱-串联质谱联用检测胆汁酸

精确移取100 μL血清样本，加入400 μL甲醇，漩涡混匀30 s，低温超声30 min（5 ℃、40 kHz），－20 ℃静置30 min，在4 ℃条件下13 000×g离心15 min，取上清液200 μL上机检测。实验采用液相色谱-串联质谱检测，对样品中的目标物进行定性定量检测，色谱与质谱参数条件同1.3.9.1节。色谱流动相梯度如表2所示，流动相A为0.1%甲酸-水溶液，流动相B为0.1%甲酸-乙腈。

表2 液相色谱检测胆汁酸的流动相梯度Table 2 Gradient mobile phase program for liquid chromatography of bile acids

1.3.9.3 胆汁酸质量浓度的计算

在定量软件SCIEX OS中采用默认参数对各离子碎片进行自动识别和积分，并辅助人工检查。以分析物的质谱峰面积为纵坐标，以分析物的质量浓度为横坐标绘制线性回归标准曲线。将样品分析物的质谱峰面积，代入线性方程中，计算上样溶液中胆汁酸的质量浓度。血清中的胆汁酸质量浓度计算如公式（2）所示。

式中：ρ为上机测定的质量浓度/（ng/mL）；V1为定容的体积/mL；V2为取样体积/mL。

1.4 数据处理与分析

使用CaseViewer成像软件和图像分析系统定量分析血管、结肠、肝脏的染色组织切片。采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析和多重比较。采用OriginPro 8.5及GraphPad Prism 8.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 高脂血症大鼠模型的建造

高脂饲料喂养2周后大鼠的血脂指标如表3所示，相对于正常饲料喂养组，高脂饲料组的大鼠TG、TCHO和LDL-C浓度显著增大（P＜0.05），而高脂饲料组大鼠血脂指标HDL-C浓度显著降低（P＜0.05）。这表明采用高脂饲料喂养大鼠2周后可成功造成高脂血症大鼠模型，这与金柑多糖降血脂机制中高脂血症大鼠的造模结果[15]一致。

表3 高脂饲料喂养两周对大鼠血脂指标的影响Table 3 Effect of high-fat diet feeding for two weeks on lipid profile in rats

2.2 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠体质量的影响

生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠体质量的影响如表4所示，造模开始时，各适应性喂养1周的大鼠的体质量无显著性差异，体质量均在130 g左右。采用高脂饲料喂养2周后，给药前的高脂血症大鼠的体质量显著高于NC组的大鼠体质量（P＜0.05），而HM、PC、GRS2、GRS3、GRS4组和HMS组大鼠体质量无显著性差异。经过4周的灌胃辛伐他汀、生姜抗性淀粉和HMS，各组大鼠体质量均高于NC组大鼠；相对HM组，PC组、生姜抗性淀粉组和HMS组大鼠的体质量显著降低（P＜0.05），其中，PC组和GRS4组大鼠体质量最小，且两组无显著性差异（P＞0.05）。这表明生姜抗性淀粉能显著降低高脂血症大鼠的体质量，该结果与RS2型香蕉抗性淀粉[17]、RS3型鹰嘴豆抗性淀粉[18]和RS4型甘薯抗性淀粉[19]对高脂血症动物体质量影响结果一致，抗性淀粉可在一定程度上控制高脂动物的体质量增长。

表4 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠体质量的影响Table 4 Effect of ginger resistant starch on body mass in hyperlipidemic rats

2.3 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠脏器指数的影响

生姜抗性淀粉对高血脂症大鼠肝脏、肾脏、脾脏、胸腺和心脏等脏器指数的影响如表5所示，经过4周的给药处理，各组大鼠的肾脏和心脏的脏器指数无显著性差异（P＞0.05）。相对于HM组大鼠，灌胃4周辛伐他汀、生姜抗性淀粉和HMS能显著降低大鼠的肝脏指数（P＜0.05），PC组和GRS4组效果最佳，这表明高脂饲料会损害大鼠的肝脏，使之出现肿大现象，而生姜抗性淀粉可在一定程度上减轻大鼠的脂肪肝损伤，该结果与大米抗性淀粉对高脂小鼠肝脏指数影响的结果[20]一致。就脾脏指数来说，HM组大鼠显著高于其他组大鼠，NC和PC组大鼠脾脏指数最低，且两者无显著差异；生姜抗性淀粉组及HMS组之间无显著性差异。NC组大鼠的胸腺脏器指数最低，其他组之间无显著差异。这表明高脂饲料喂养会在一定程度上损害大鼠的免疫器官。

表5 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠脏器指数的影响Table 5 Effect of ginger resistant starch on visceral organ indexes of hyperlipidemic rats

2.4 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠血脂指标的影响

生姜抗性淀粉对高血脂症大鼠血脂指标的影响如表6所示，相对于HM组，灌胃PC、生姜抗性淀粉和HMS均能显著降低大鼠血清的TG和TCHO浓度（P＜0.05），且3种生姜抗性淀粉组大鼠的TG和TCHO浓度均显著小于HMS组大鼠，这表明生姜抗性淀粉能降低高脂血症大鼠的血脂水平，尤其是GRS3和GRS4的效果最佳。HDL-C能将外周组织如血管壁内胆固醇转运至肝脏进行分解代谢，即胆固醇逆转运，可减少胆固醇在血管壁的沉积[15]。由表6可知，PC、生姜抗性淀粉和HMS组大鼠的HDL-C浓度显著高于HM组大鼠，且显著高于NC组，这与其他抗性淀粉对大鼠血清HDL-C浓度的影响不一致，比如甘薯抗性淀粉组的HDL-C浓度低于NC组[21]。HDL-C可以将身体的胆固醇运输到身体各个器官，来提高身体免疫力，防止动脉出现硬化的情况[22]。Zanoni等[23]发现在SCARB1基因缺失的人群中，虽然HDL-C浓度显著高于正常人，但他们患心血管疾病的风险比常人更高，缺失了这个基因的人群无法利用HDL-C从外周运输来的胆固醇，机体为了代偿而产生更多HDL-C，以将更多的外周胆固醇运回肝脏。但事实是，产生更多的HDL-C也无法将外周胆固醇运回肝脏并代谢掉。因此，适当浓度水平的HDL-C才有益机体健康[24]。相对于HM组，灌胃PC、生姜抗性淀粉和HMS均能显著降低大鼠的LDL-C浓度，尤其是PC组大鼠的LDL-C浓度最低，这是因为辛伐他汀是通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA）还原酶降低LDL-C浓度的他汀类药物[25]。LDL-C则会把携带的胆固醇堆积在动脉壁上[26]，含量过高会引起动脉硬化，生姜抗性淀粉能够降低这种风险。

表6 生姜抗性淀粉对高血脂症大鼠血脂指标的影响Table 6 Effect of ginger resistant starch on blood lipid indexes in hyperlipidemic rats

生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠ALT和AST活力的影响如图2所示，PC、GRS2、GRS3、GRS4组及HMS组大鼠血清AST、ALT含量均显著低于HM组（P＜0.05）。当肝细胞发生炎症、中毒、坏死等时会造成肝细胞的受损，转氨酶便会释放到血液里，使血清转氨酶活力升高[27]。动物体内最重要的转氨酶为ALT和AST，二者活力都是肝功能测试的重要指标。生姜抗性淀粉可以降低血清中ALT和AST的活力，这说明生姜抗性淀粉可以减轻肝脏损伤。

图2 生姜抗性淀粉对高血脂症大鼠AST活力（A）和ALT活力（B）的影响Fig. 2 Effect of ginger resistant starch on the activities of AST (A) and ALT (B) in hyperlipidemic rats

2.5 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠血管病理学影响

高脂血症大鼠心脏动脉血管病理学显微镜观察结果如图3所示，NC组大鼠血管内皮细胞结构连续且完整，血管层次清楚；内膜光滑，内皮下未见炎症细胞浸润及脂质性物质；中层及血管外模结构完整清晰，未见组织细胞脱落；血管中膜层菱形平滑肌细胞排列整齐，存在少量的纤维成分，未见脂肪细胞（图3A）。HM组大鼠血管内膜增厚并在血管内呈现隆起、折叠状态；血管外壁组织细胞松散脱落，细胞间隙增宽（图3B红色箭头）；血管内膜中存在水肿现象，有水泡状细胞浸润；血管中膜层存在大量圆形泡状脂肪细胞，平滑肌细胞出现增生，细胞生长排列紊乱且穿透内膜生长并向血管内膜迁移；血管组织形态发生病变（图3B）。PC组大鼠血管组织形态经药物灌胃得到有效改善，血管层次、内膜结构及血管外壁较HM组有所改善。以上结果与金柑多糖对高脂血症大鼠血管病理学影响的结果[15]一致。GRS2组和HMS组中可见少量圆形泡状脂肪细胞（图3D、G红色箭头），其泡状脂肪细胞明显少于HM组（图3C）。经生姜抗性淀粉GRS3、GRS4组灌胃后的高脂血症大鼠血管状态均有不同程度的改善，血管内皮细胞结构连续且完整，血管层次清楚（图3E、F），且生姜抗性淀粉效果优于HMS。

图3 高脂血症大鼠血管病理学观察结果Fig. 3 Observation of vascular pathology in hyperlipidemic rats

2.6 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠结肠组织病理学的影响

大鼠结肠位于右髂窝内，续于盲肠，在第3骶椎平面连接直肠，由升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠4 段组成，结肠大部分固定于腹后壁[28]。结肠横切面由内到外依次为：黏膜（包括上皮层、固有层、黏膜肌层）、黏膜下层（为疏松的结缔组织）、肌层（为内环形、外纵行两层平滑肌）和外膜（包括纤维膜或浆膜）[29]。生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠结肠形态的影响如图4所示，NC组大鼠结肠肌层厚，组织结构紧密，细胞排列整齐；结肠绒毛在结肠内呈折叠状态整齐排列，绒毛与黏膜连接紧密（图4A箭头）。HM组大鼠结肠肌层较NC组薄，基层外表面组织结构松散，杯状细胞数量明显减少，细胞有脱落现象，结肠绒毛稀疏，仅在结肠内表面附着，结肠内空间空洞（图4B方框和箭头），由此可知，高脂膳食破坏了大鼠结肠黏膜层的完整性，对结肠结构造成了损伤。PC组大鼠结肠肌层、黏膜及绒毛状态均有所改善（图4C箭头）。经生姜抗性淀粉GRS2、GRS3、GRS4灌胃后的高脂血症大鼠结肠状态较HM组有明显改善，结肠组织隐窝和杯状细胞结构清晰，其肌层厚度、黏膜厚度及绒毛长度增加（图4D～F箭头）。HMS组大鼠结肠组织有一定的程度的损伤，结肠内容出现了糜烂（图4G方框），杯状细胞数量明显减少，且结构不清晰，基底层变薄，绒毛长度变短（图4G箭头）。

图4 高脂血症大鼠结肠组织病理学观察Fig. 4 Histopathological observation of colon tissue in hyperlipidemic rats

通过CaseViewer图像分析系统对各组大鼠结肠肌层厚度、黏膜厚度和绒毛长度进行测定，测定结果如图5所示，生姜抗性淀粉组和PC组大鼠的结肠肌层厚度、结肠黏膜厚度和结肠绒毛长度显著高于HM组大鼠，且生姜抗性淀粉GRS3对大鼠结肠黏膜和肌层的保护效果最好。其原因可能是生姜抗性淀粉的添加调节了结肠肠道菌群的组成和结构，改变肠道微环境，使结肠绒毛长度及状态得到保护，提高了结肠对营养物质的吸收和利用，从而改善了结肠肌层及黏膜状态，使结肠的功能得到显著提高。该结论与薏苡仁抗性淀粉对高脂血症大鼠结肠形态影响的结果[30]一致。

图5 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠结肠形态的影响Fig. 5 Effect of ginger resistant starch on colonic morphology in hyperlipidemic rats

2.7 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠肝脏组织病理学影响

高脂血症大鼠肝脏病理学显微镜观察结果（放大100 倍）如图6所示，NC组大鼠肝脏组织及细胞结构正常，肝小叶轮廓清晰，肝细胞结构完整清晰并呈多边形，细胞边界清晰，细胞核位于细胞中央形状呈圆形，细胞质丰富清澈，肝索以中央静脉为中心成放射状向四周排列（图6A方框）。HM组大鼠均出现了一定的肝细胞代谢病变，大鼠肝脏小叶轮廓不清晰，肝细胞着色较正常细胞着色浅，胞浆颜色浅淡，细胞质中出现了大小不等的圆形脂肪空泡（图6B箭头），肝细胞体积较正常肝细胞变大变圆，细胞核偏离细胞中心而被挤在细胞边缘，肝窦明显变窄或消失，腺泡内多见点状或灶状坏死，汇管区出现炎症细胞浸润现象，并见明显的肝纤维化，肝小叶中央静脉周显现胆固醇结晶。PC组大鼠的肝脏细胞结构完整清晰，细胞质中的脂肪泡的数量较HM组明显减少（图6C箭头），肝细胞染色加深，细胞水样病变显现消失，细胞核回归细胞中心位置，肝细胞腺泡病变坏死现象消失；GRS2组大鼠肝细胞结构完整清晰，细胞质中的脂肪泡大小及数量较HM组明显减少（图6D箭头），肝细胞着色深，肝脏小叶轮廓清晰，细胞核未见偏离细胞中心，肝脏病变现象明显好转。GRS3组大鼠肝细胞结构清晰完整，细胞质中仅见少量脂肪泡（图6E箭头所示），肝脏小叶轮廓清晰，肝窦形状未见变窄，肝脏病变好转。GRS4组（图6F）大鼠肝脏病变现象明显好转，细胞质中未见圆形脂肪泡，肝汇区炎症现象消失，肝细胞着色深，肝脏小叶轮廓清晰。HMS组大鼠肝细胞病变现象稍有好转，细胞质中仍可见一定数量的圆形脂肪空泡（图6G箭头）。以上结果与紫花芸豆抗性淀粉对高脂血症大鼠肝脏及肠屏障损伤的修复作用中肝脏病理学观察结果[31]一致。结果表明，对大鼠长期进行高脂喂养，经过消化吸收后的一部分脂肪进入肝脏，脂肪进入肝脏后贮存并形成脂肪肝，造成肝脏的一系列病变。经GRS2、GRS3、GRS4灌胃后的高脂血症大鼠，其肝脏细胞质中的脂肪空泡数量较HM组明显减少，脂肪空泡明显变小，3种生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠肝脏保护作用较HMS的效果好。

图6 高脂血症大鼠肝脏组织病理学观察Fig. 6 Histopathological observation of liver tissue in hyperlipidemic rats

2.8 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠血清初级胆汁酸质量浓度的影响

采用靶向代谢组学技术测定25种胆汁酸，其中，初级胆汁酸10种、次级胆汁酸15种。生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠血清初级胆汁酸质量浓度的影响如图7所示，各组中游离型初级胆汁酸（胆酸、鹅脱氧胆酸、β-鼠胆酸和α-鼠胆酸）质量浓度明显高于结合型初级胆汁酸（牛磺胆酸、牛磺-α-鼠胆酸、牛磺-β-鼠胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸）质量浓度，这表明，大鼠血清中主要以游离型初级胆汁酸为主[32]。生姜抗性淀粉组大鼠血清中游离型初级胆汁酸整体上显著低于HM组大鼠，尤其是GRS3和GRS4组大鼠，这与生姜抗性淀粉对高血脂症大鼠血脂指标影响的结果一致。PC组、生姜抗性淀粉组和HMS组大鼠血清中牛磺胆酸、牛磺-α-鼠胆酸、甘氨胆酸等结合型初级胆汁酸质量浓度无显著差异。PC组、生姜抗性淀粉组和HMS组大鼠血清中牛磺-β-鼠胆酸质量浓度均显著低于HM组大鼠，而GRS4和HMS组大鼠的牛磺鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸却显著高于HM组大鼠，这可能与胆汁酸之间的转化有关[33]。以上结果表明，生姜抗性淀粉主要是通过降低血清中的游离型初级胆汁酸来调节高脂血症大鼠的血脂代谢。

图7 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠血清初级胆汁酸质量浓度的影响Fig. 7 Effect of ginger resistant starch on serum primary bile acid contents in hyperlipidemic rats

2.9 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠血清次级胆汁酸质量浓度的影响

生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠血清次级胆汁酸质量浓度的影响如图8所示，高脂血症大鼠血清中主要含有脱氧型次级胆汁酸，如猪脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、脱氧胆酸、牛磺猪脱氧胆酸、鼠脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸和甘氨脱氧胆酸等，其中，猪脱氧胆酸和熊脱氧胆酸等游离型脱氧型次级胆汁酸的质量浓度最高。相对于HM组，PC、生姜抗性淀粉组和HMS组大鼠血清中猪脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、ω-鼠胆酸、脱氧胆酸、牛磺猪脱氧胆酸、别胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、猪胆酸、石胆酸和7-酮基石胆酸等质量浓度整体上显著降低，其中，GRS3、GRS4组和HMS组降低血清中上述次级胆汁酸质量浓度的效果最佳。而GRS2组大鼠血清中次级胆汁酸7-脱氢胆酸、鼠脱氧胆酸和熊果胆酸等质量浓度高于HM组。GRS2能够增加大鼠血浆中上述次级胆汁酸的质量浓度，可能是因为其可影响结肠中微生物组成和结构，从而调节肝肠轴中胆汁酸组成和质量浓度的变化[34]。GRS3和GRS4主要降低大鼠血清中脱氧型次级胆酸（如猪脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、脱氧胆酸、牛磺猪脱氧胆酸和甘氨熊脱氧胆酸等）质量浓度。

图8 生姜抗性淀粉对高脂血症大鼠血清次级胆汁酸质量浓度的影响Fig. 8 Effect of ginger resistant starch on serum secondary bile acid contents in hyperlipidemic rats

3 结 论

本实验研究表明，相对HM组，辛伐他汀、生姜抗性淀粉和HMS能显著降低高脂血症大鼠的体质量和肝脏指数，辛伐他汀和GRS4效果最佳。辛伐他汀、生姜抗性淀粉和HMS均能显著降低高脂血症大鼠血清的TG、TCHO、LDL-C浓度，显著降低ALT和AST活力，显著提高HDL-C含量，GRS3和GRS4的效果最佳。由组织病理学观察发现，GRS3和GRS4能改善高脂血症大鼠血管层次、内膜结构及血管外壁结构；增加结肠肌层厚度、黏膜厚度及绒毛长度，使结肠组织隐窝和杯状细胞结构清晰；减少肝脏细胞质中的脂肪空泡数量和大小，且效果优于HMS。此外，生姜抗性淀粉GRS3和GRS4能够显著降低血清中的游离型初级胆汁酸（如胆酸、鹅脱氧胆酸、β-鼠胆酸和α-鼠胆酸）和脱氧型次级胆酸（如猪脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、脱氧胆酸、牛磺猪脱氧胆酸和甘氨熊脱氧胆酸）的质量浓度，GRS3和GRS4主要通过降低血清中的游离型初级胆汁酸和脱氧型次级胆酸含量来改善高脂血症大鼠的血脂代谢。