CMAB008单抗阳离子交换层析介质寿命确认

邵顺儒 郭清城 侯盛 袁秀珍 徐忠升 范文强 张蕙 朱红帅 邵景德

摘要：建立CMAB008单抗阳离子交换层析介质寿命确认方案，采用实际生产的工艺参数进行缩小模型试验，以考察Nuvia S层析介质循环到100次后性能指标是否还满足层析需要。按试验方案对Nuvia S层析介质循环到100次，分别在使用前和循环使用20、40、50、70、90次后对层析柱进行柱效测试，以考察随循环次数的增加，层析介质对层析柱对称因子、理论塔板数的影响;对循环1、50、51、100次的层析柱进行动态载量测试，以考察洗脱峰的ProteinA残留、HCP残留、DNA残留、毛细管电泳纯度、SEC-HPLC纯度、活性、得率;以不同上样量20 g/L（循环8、48、88次）、40 g/L（循环9、49、89次）、80 g/L（循环61、62、63次），不同流速110 cm/h（循环10、50、92次）、149 cm/h（循环61、62、63次）、170 cm/h（循环11、59、93次）上样以考察阳离子交换层析洗脱峰SEC-HPLC纯度、得率。结果表明，使用前和循环使用20、40、50、70、90次后柱效测试中，所有对称因子、理论塔板数均在可接受的标准范围内;循环1、50、51、100次的层析柱动态载量测试结果均高于起始动态载量的80%，洗脱峰的ProteinA、HCP、DNA残留检测未有增高趋势，毛细管电泳纯度、SEC-HPLC纯度、活性以及得率未有下降趋势;上样测试结果显示，洗脱峰的SEC-HPLC纯度无明显变化趋势，均大于98%，得率均大于85%。这些试验结果均符合CMAB008原液纯化工艺要求。结果证明，Nuvia S层析介质在循环到100次时性能指标没有下降，可以保证纯化CMAB008单抗产品的质量。

关键词：CMAB008单抗;层析介质寿命;缩小模型;性能指标

中图分类号：R318.08   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）08-0069-04

自1972年基因工程技术问世以来，现代生物工程又经历飞速发展近50年，新世纪人们把更多的关注投向生物工程产业，使生物工程产业迅速崛起，特别是现代医药生物工程产业发展迅速，基因诊断、基因治疗、人类基因组计划、生物芯片、转基因动物、RNA干扰、基因工程抗体、人源化抗体、治疗性疫苗和抗体[1]等成果层出不穷，技术日新月异，令人目不暇接。一大批基因工程药物如雨后春笋般不断涌现，给人类健康和疾病治疗带来新的治疗模式，社会对生物制品的需求与日俱增。《药品注册管理办法》要求药品安全、有效、质量可控[2]。生物制品不仅要保证药品的有效性，同时也不能影响其生产工艺稳定性[3]。在现代化的生物制品生產过程中，在工艺上要经过膜过滤法[4]、色谱法[5-6]、超短时微波加热法、巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/去污剂（S/D）法和低pH值孵放法[7]等至少2种以上的方法进行病毒的去除/灭活[8-9]，还要经过层析法通过高度的纯化得到安全、有效、质量可控的产品。现代的层析技术非常广泛，层析技术是原液纯化的关键步骤，通过对收集到的中间产品进行纯化以得到符合工艺要求的高纯度的生物制品。对于纯化技术使用的层析介质的管理目前是药品监督管理部门日常监督检查、GMP合规检查、药品注册现场核查关注的重点。层析介质的清洗、储存、使用次数均需要通过验证进行确认，这在现行的2010年版GMP附录生物制品中有明确的要求[10]。层析介质成本昂贵，减少国家有限资源的浪费及降低企业生产成本都需要层析介质反复使用多次，但经过层析介质多次使用，其纯化能力会发生改变，使纯化效果变差，以致影响层析样品的质量，造成最终使用的制剂有安全隐患。层析介质的关键性能指标主要包括目标产品的纯度、收率，动态载量减少，去除目标杂质（内毒素、宿主蛋白和宿主DNA等）的能力，层析柱在使用中的物理性（装柱高度/上样柱压、上样液的流动速度等）的改变等[11]，因此层析介质的使用寿命需要经过严格和科学的验证，这不但保证了药品的质量，而且还减少国家有限资源的浪费，同时降低企业生产成本。

本试验建立CMAB008单抗纯化的阳离子交换层析介质寿命确认方案，按方案取相应循环后的阳离子交换层析进行，动态载量测试，阳离子交换层析洗脱峰的ProteinA、HCP、DNA残留检测，SEC-HPLC 纯度、活性检测;检测不同上样量、不同流速阳离子交换层析洗脱峰SEC-HPLC纯度、得率;考察经过100个循环后的层析介质是否仍满足生产工艺需求，也为其他生物制品的层析介质寿命研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 层析设备及介质 AKTA-avant150层析系统、XK16/40层析柱、Tricorn 10/20层析柱、Nuvia S层析介质。

1.1.2 主要试剂 NaOH、乙酸钠、乙酸、氯化钠。按生产工艺的要求配制冲洗液、平衡液、洗脱液、再生液、消毒液、保存液;阳离子交换层析上样液为笔者所在公司CMAB008产品完成亲和层析的中间产品。

1.2 方法

工业化生产时的层板柱内径400 mm，柱高 700 mm。实际使用时一般装柱高度160～240 mm。本试验采用与生产相同的柱高，通过缩小柱直径的方式，实现线性的模型缩小来测试Nuvia S层析介质的使用寿命，计划按实际工艺流程，进行100个循环的试验。前50个循环以XK16/40型号层析柱进行验证，后50个循环以Tricorn 10/20型号层析柱进行验证。

在江苏泰州迈博太科药业有限公司应用AKTA-avant150层析系统，进行试验，试验时间为2017年7—9月。按照和生产工艺相同的参数进行100个循环，每个循环都有完整的步骤：消毒、冲洗、前平衡、上样、上样后平衡洗涤、洗脱收集、再生、消毒、保存。第8、48、88次循环层析介质上样量20 g/L;第9、49、89次循环层析介质上样量 40 g/L;其他非动态载量测试循环层析介质上样量80 g/L。线性流速采用工艺流速的上下限及生产流速，其中上下限分别做3组有效数据的验证循环。第10、50、92次循环流速改为110 cm/h;第11、59、93次循环流速改为170 cm/h;其他非动态载量测试循环流速为生产流速149 cm/h。为了评估Nuvia S层析介质的性能，按设计的验证方案取样检测。每个循环的流程及参数见表1。取样和测试项目见表2。

2 结果与分析

2.1 柱效测试结果

循环1～50次使用XK16/40型号层析柱，装柱高度237 mm，柱体积47.6 mL;循环51～100次使用Tricorn 10/20型号层析柱，装柱高度210 mm，柱体积16.5 mL，装柱高度符合商业生产时的要求（160～240 mm）。对使用前和20、40、50、70、90次循环后进行柱效测试，测试结果为对称因子、理论塔板数均在可接受的标准范围内（表3），说明经过近90次循环后，层板介质性能没有明显变化趋势。

2.2 动态载量测试结果

从Nuvia S层析介质循环1、50、51、100次后的检测数据（表4）可以看出，活性（生物学活性、结合活性）、SEC-HPLC纯度（聚体、单体）、毛细管电泳纯度、DNA去除率、HCP去除率、ProteinA去除率均无明显下降趋势，且1、50、51、100次循环后动态载量测试结果均满足Nuvia S层析使用寿命确认方案的可接受标准。

2.3 不同上样量测试结果

根据Nuvia S层析介质使用寿命确认方案中的要求，测试不同的上样量（20、40、80 g/L）对阳离子交换层析工艺、质量的影响，从表5可以看出，SEC-HPLC 纯度（聚体、单体）、得率均满足工艺和质量要求。

2.4 不同流速测试结果

根据Nuvia S层析介质使用寿命确认方案中的要求，测试不同流速（110、149、170 cm/h）对阳离子交换层析工艺、质量的影响，从表6可以看出，SEC-HPLC纯度（聚体、单体）、得率均满足工艺和质量要求。

3 讨论与结论

在生物制药领域，层析纯化是关键步骤，层析介质循环使用次数直接影响分离提纯效果[12]。根据不同产品特性和物料性质，介质寿命均不相同。离子交换层析技术是蛋白类样品纯化处理经常使用的层析技术[13]。对40种基因重组蛋白质和94 种非重组蛋白质生产过程调查统计结果表明，在共有426次层析工序中离子交换层析比例占有40%[14]。单克隆抗体制剂的原液在生产过程中离子交换层析，一般用在亲和层析之后，用于去除亲和层析没有除去的聚体、DNA残留、病毒颗粒以及亲和层析介质中脱落的蛋白A配基。阳离子交换层析还可替代亲和层析用在单克隆抗体制剂原液在生产过程中的纯化捕集。现在大约有6%的单克隆抗体制剂采用了阳离子交换层析捕集纯化抗体[15]。与亲和层析相比，阳离子交换层析不但有较高的蛋白结合容量，解决单克隆抗体纯化过程中要分多次上样问题，而且阳离子交换层析介质成本远低于亲和层析介质。本研究以Nuvia S层析介质为例，通过小规模的试验，来检测介质寿命。阳离子交换层析的原理是通过电荷差异进行阳离子捕获，核酸和内毒素带负电，大部分不结合阳离子交换层析，相反，不少单抗属于碱性蛋白质，可在合适的pH值下结合阳离子交换层析，让核酸和内毒素穿透。针对其纯化原理，研究介质寿命验证方法，为研究不同用途的层析介质寿命提供思路与数据支持。介质寿命验证是药品研发，尤其是生物制品的重点关注内容。企业在做介质寿命验证时，建议采用等比例缩小纯化规模确定每步纯化所用介质的使用次数，确保层析介质寿命在使用期限内使用，介质符合生产需求，防止交叉污染，保障产品的质量。层析介质在每次使用时，未被洗脱和流穿的物质或杂质会吸附在填料上，需要采用特定的清洗和再生程序对层析介质进行清洗、再生、保存，以恢复介质最初状态。长期使用的介质，会逐渐失去效力，如清洗后污染物残留量、介质使用参数变化、产品重要指标（ 纯度） 和收率均不在控制范围之内，则说明介质的寿命已到期。本试验中按设计的验证方案层析介质循环到100次，按验证方案对相关的工艺参数、质量指标进行测试，与产品实际商业生产的工艺参数、质量指标作对比，如不在工艺参数、质量指标要求范围内，则说明介质应该更换了，只有对层析介质进行及时更换，才能确保生物制品质量。本研究结果显示，Nuvia S阳离子层析介质经过100次循环后动态载量测试结果高于起始动态载量的80%，柱效没有下降趋势，阳离子交换层析洗脱峰的ProteinA、HCP、DNA残留检测未有增高趋势，SEC-HPLC纯度（聚体、单体）、活性（生物学活性、结合活性）以及得率未有下降趋势;分别以不同上样量20 g/L（循环8、48、88次）、40 g/L（循环9、49、89次）、80 g/L（循环61、62、63次），不同流速110 cm/h（循环10、50、92次）、149 cm/h（循环61、62、63次）、170 cm/h（循環11、59、93次）进行验证，阳离子交换层析洗脱峰检测结果显示SEC-HPLC纯度（聚体、单体）无明显变化趋势，均大于98%，得率均大于85%。这些试验数据均符合CMAB008原液纯化工艺及质量标准要求。试验证明，Nuvia S阳离子层析介质经过100次循环后还可以保持纯化效果，因此暂定该Nuvia S阳离子层析介质使用寿命为100次循环，在商业生产过程中，对这次试验中确定的使用次数进行监测和确认。

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