多指标-响应曲面法优选连翘中抗痤疮有效部位的提取工艺研究

李思思，遆安航，谭丽媛，翟康欣，张淑蓉

（山西中医药大学，山西 晋中 030619）

连翘为木樨科植物连翘［Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl］的干燥果实，传统中医学认为连翘具有消肿、清热、散结等作用，素有“疮家圣药”之称。“连翘主治一切炎性疾患，如痈疽、瘰疬、乳痈、丹毒、风热感冒、温病初起、温热入营、高热烦渴、神昏发斑、热淋涩痛等［1］”。现代药理研究发现其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、解热等药理作用［2-3］，得益于连翘中含有的苯乙醇苷类、木脂素类、萜类、黄酮类等多种类型的化合物。痤疮好发于青少年，丙酸杆菌是痤疮发生的致病菌之一，抗菌治疗是抗痤疮的必要手段。氧化应激是由于细胞中产生了过多的活性物质，如活性氧簇和活性氮簇，超过抗氧化物的清除能力，导致了大分子生物（糖、脂质及与蛋白质）的氧化，氧化应激反应是引发痤疮的重要因素，所以抗氧化也是治疗痤疮的有效措施［4］。本试验选择兼具抗菌、抗氧化的连翘酯苷B、连翘酯苷A、芦丁为参考指标，以HPLC法为检测手段，考察不同溶剂、不同提取时间、提取次数、溶剂加入量对连翘抗痤疮有效部位提取工艺的影响，使用Box-Behnken响应曲面法对提取工艺进行优化，最终确定最佳提取工艺，为后续制备连翘抗痤疮洗护用品提供参考和依据。

1 仪器与试药

Waters e2695型高效液相色谱仪；MF204十万分之一天平（瑞士梅特勒托利多公司）；FA224千分之一电子天平（上海舜宇科学仪器有限公司）；HDM-500数显电热套（金坛杰瑞尔电器）。连翘药材采自山西太原汾河公园（蒸制30 min后在60℃以下烘干），经山西中医药大学裴香萍教授鉴定为《中国药典》收录品种；连翘酯苷B对照品（批号111810-201907）、连翘酯苷A对照品（批号161079-160828）、芦丁对照品（批号161153-160831）均购自中国食品药品检定研究院；甲酸（色谱纯，天津市光复科技发展有限公司）；无水乙醇（分析纯，天津市北辰方正试剂厂）；甲醇（色谱纯，天津市天力化学试剂有限公司）；娃哈哈纯净水（娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验色谱条件

色谱柱BDSHYPERSIL C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱，程序见表1。HPLC流速1.0 mL/min，柱温为25℃，检测波长为270 nm，进样体积为10μL。

表1 梯度洗脱条件

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取连翘酯苷B、芦丁和连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成含连翘酯苷B对照品0.227 mg/mL、连翘酯苷A对照品0.766 mg/mL和芦丁对照品0.318 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 使用万分之一天平量取连翘20 g，并置于圆底烧瓶中，精密加入60%乙醇溶液280 mL并称定重量，加热回流2.5 h，使用3层纱布滤过，按以上步骤重复操作3次，合并滤液，确定滤液体积，使用移液管将滤液精密量取1 mL置10 mL量瓶中，使用60%乙醇进行定容，摇匀，滤过，将续滤液用0.45μm微孔滤器过滤，得到供试品溶液。

2.3 测定法

精密吸取2.2.1项下对照品溶液、2.2.2项下供试品溶液各10μL，使用2.1项下色谱条件对其进行测定，结果见图1、图2。由图可知，各成分峰形对称，分离度良好。

图1 混合对照品溶液HPLC图

图2 连翘HPLC图

2.4 线性关系考察

分别精密称取连翘酯苷B、连翘酯苷A和芦丁对照品8.04 mg、3.57 mg、4.22 mg，置于10 mL的容量瓶中，加入甲醇使其溶解，稀释至刻度并且摇匀，作为混合对照品母液。分别精密量取1mL、2mL、3 mL、4 mL、5 mL置于不同的10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得不同浓度的对照液，按上述色谱条件测定峰面积。以各有效峰的面积（Y）为纵坐标，对照品的浓度（C，μg/mL）为横坐标，得连翘酯苷B线性方程为：Y=5565X+213 887（r=0.9998）、连翘酯苷A线性方程为：Y=5984.6X+50 282（r=0.9998）、芦丁：Y=16 086X+41 933（r=0.9999），分别在0.1054～0.817 mg/mL、0.332～1.665 mg/mL、0.0836～0.453 mg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，对各峰面积进行测定，计算得连翘酯苷B、连翘酯苷A和芦丁的RSD值分别为0.56%、0.95%、0.73%，均小于3%。表明该仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批次连翘药材6份，按供试品制备项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件对其进行含量测定。结果表明连翘酯苷B、连翘酯苷A和芦丁的RSD值分别为2.74%、2.35%、2.83%。说明该方法有良好的重复性。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下同一供试品溶液10μL，于0 h、2 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h分别进样，按上述色谱条件测定，结果显示连翘酯苷B、连翘酯苷A和芦丁含量的RSD值分别为0.1%，0.01%，0.04%。结果显示供试品溶液在30 h内具有良好的稳定性。

2.8 加样回收试验

精密量取2.2.2项下已知浓度的连翘提取液0.5 mL各6份，分别加入一定量的对照品溶液，按含量测定项下的方法进行操作，测定连翘药材中各成分的平均回收率和RSD值。试验结果显示连翘提取液中连翘酯苷B、连翘酯苷A和芦丁的平均回收率分别是99.6%、100.8%、99.7%，RSD值分别是0.77%、1.08%、0.61%。说明该方法具有良好的准确度。

2.9 单因素考察

以连翘酯苷B、连翘酯苷A、芦丁含量的综合评分值［1］（Y）为评价指标［Y=（连翘酯苷B含量/连翘酯苷B含量max）×30%+（连翘酯苷A含量/连翘酯苷A含量max）×40%+（芦丁含量/芦丁含量max）×30%］，对提取溶媒（水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、100%乙醇）、不同煎煮时间（0.5、1、2、2.5、3 h）、提取溶媒加入量（6、8、10、12、14、16倍量）进行考察，考察结果见图3～5。

图3 不同提取溶媒考察结果

图4 溶剂加入量考察结果

图5 提取时间考察结果

根据单因素考察结果，在进行Box-Behnken响应曲面分析时，提取溶媒选择60%乙醇，提取时间选择1.5 h、2 h、2.5 h；在溶剂加入量选择中，由于单因素考察中14倍量至16倍量Y值变化不大，综合考虑成本问题，选用10倍、12倍、14倍溶剂加入量作为考察指标；提取次数一般不超过3次，所以选用1次、2次、3次为考察指标。

2.10 Box-Behnken响应曲面法

以煎煮次数（A）、溶剂加入量（B）和提取时间（C）为影响因素进行考察，以连翘酯苷B、连翘酯苷A和芦丁综合评分值（Y）为评价对象，设计3因素3水平共17组试验。因素水平表见表2，试验设计与结果见表3，方差分析见表4。由表4可知，因素A有极其显著的影响（P＜0.01），因素B与A2均具有较显著的影响（0.01＜P＜0.05）。回归方程 为Y=86.31+11.77A+3.99B+2.30C+1.79AB-1.06AC+0.6675BC-4.91A2-2.39B2+3.13C2。相关系数r=0.9656，拟合情况良好。调整相关系数r=0.9195，可以解释91.95%响应值的变化，可以用于预测分析［5-7］。

表2 因素水平表

表3 试验设计与结果

通过Design Expert软件对表4数据进行响应面分析，结果见图6。其中图a（固定煎煮时间不变）显示，煎煮次数不变时，随着料液比增大响应值一直趋于平稳；料液比不变时，随着煎煮次数增加，响应值先升高后趋于平稳（煎煮2～3次时响应值最高）。图b（固定料液比不变）显示，煎煮次数不变时，随着煎煮时间增长，响应值趋于平稳；煎煮时间不变时，随着煎煮次数增多，响应值先上升后趋于平稳（煎煮时间为2～2.5 h，煎煮3次时响应值最高）。图c（固定煎煮次数不变）显示，料液比不变时，随着煎煮时间延长，响应值趋于平稳；煎煮时间不变时，响应值缓慢升高（料液比为1∶14时，响应值最高，而煎煮时间影响不大）。综上所述，直观得出结论煎煮时间为2.5 h，煎煮3次，料液比为1∶14时为最优工艺。软件所得最佳提取工艺与直观一致［2］。

表4 方差分析

图6 响应曲面图

2.11 验证试验

对Design-Expert软件所得的优化工艺进行验证试验（n=3），结果见表5。最终确定提取工艺为用60%乙醇提取，提取3次，每次2.5 h，料液比为1∶14。

表5 验证试验结果

3 讨论

痤疮在青少年中发病率极高，且容易复发，不仅对患者的外貌造成影响，还会严重影响到青少年的心理健康和生活质量。连翘被称之为“疮家圣药”，现代药理实验发现其具有确切的抗菌作用［8］。本课题组前期试验采用薄层自显影技术对连翘中的熊果酸、连翘酯苷A、齐墩果酸、芦丁、连翘苷进行抗氧化活性成分筛选［3］，见图7。结果发现连翘酯苷A、芦丁具有明显的抗氧化作用。在连翘药材薄层自显影中，与连翘酯苷A对照相应的位置，显色斑点较大，结合HPLC色谱图，分析其可能为连翘酯苷A与连翘酯苷B未分离开的共同斑点；且通过连翘酯苷B对照品与显色试剂反应，证实连翘酯苷B也具有抗氧化作用。故实验选用兼具抗菌、抗氧化的连翘酯苷A、连翘酯苷B、芦丁等3种成分为考察指标进行抗痤疮有效部位的筛选。

图7 连翘抗氧化活性成分筛选

实验采用多指标-响应曲面法确定的连翘中抗痤疮有效部位的提取条件为：提取溶媒60%乙醇，提取3次，每次2.5 h，溶媒加入量为14倍量。提取工艺简便、易于操作，且专属性强，可为后续开发连翘抗痤疮洗护用品提供技术依据。