基于模糊综合评判法评价不同加热模式对丹参提取物药效学的影响

张 宁，徐 剑,2,3*，徐 雪，刘 明,2,3，缪艳燕,2,3，张永萍,2,3，周雪娇

（1.贵州中医药大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省中药民族药炮制与制剂工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；3.国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025）

提取方法是影响中药临床疗效的关键环节[1-2]。目前中药提取方法有煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流法、索氏提取法、水蒸气蒸馏法等，传统加热方式在提取过程中存在效率低、能耗高等问题[3]，建立绿色节能高效的提取方式是提高中药制造业现代化水平的需求[4]。微波加热是对物质内外同时整体进行加热，在提取效率上优于传统提取技术[5-7]。由于微波产生热源的方式不同于传统加热方式，势必影响中药提取过程中成分的浸出，对药效是否产生影响还有待验证。为了探讨微波加热对药效的影响，本研究以丹参为模型药，通过腹腔注射盐酸异丙肾上腺素建立大鼠急性心肌缺血模型，采用模糊综合评判法对不同加热模式丹参提取物的药效进行综合评价，以期为中药微波提取物在临床的广泛应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠50 只，雌雄各半，体质量为200 ～ 250 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2014-0011。所有大鼠均适应性喂养7 d 后进行试验。

1.1.2 药物与试剂 丹参（贵州同济堂中药饮片有限公司，批号：C180612）；复方丹参片（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：L18A040）；盐酸异丙肾上腺素注射液（上海禾丰制药有限公司，批号：41181101，规格：2 mL ∶1 mg）；SOD 试剂盒（批号：20190614）、MDA 试剂盒（批号：20190612）、CK 试剂盒（批号：20190614）、LDH 试剂盒（批号：20190614）、总蛋白定量测试盒（批号：20190808）均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 主要仪器 BL-420型生物机能实验系统（四川成都泰盟科技有限公司）；SK8210 HP 型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；TGL-16B 型离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-4 型数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；OPWO8S 型澳润微波提取器（南京澳润微波科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 传统加热：称取丹参适量，用10 倍量95%乙醇加热回流1.5 h，过滤；滤渣加10倍量50%乙醇回流1.5 h ，过滤；滤渣用10 倍量水回流2 h，过滤，合并三次滤液，减压浓缩至干浸膏，并放置干燥器中保存。微波加热基于课题组前期的研究，设置功率为600 W[8]。其它参数与传统提取法一致。

1.2.2 分组、给药及模型制备 取50 只大鼠分为正常组、模型组、阳性药物组（复方丹参片0.6 mg/g）、微波加热组、传统加热组，共5 组，每组10 只。微波加热组、传统加热组的给药剂量以生药量计算为5.4 mg/g，正常组、模型组大鼠灌胃给予等容积生理盐水。大鼠急性心肌缺血模型的建立：大鼠连续给药14 d，各给药组从第12 天给药30 min 后，除正常组外，其余各组均腹腔注射盐酸异丙肾上腺素（0.005 mg/g），每天1 次，连续3 d。

1.2.3 大鼠心电图ST段的测定 第14天给药30 min后，用2%戊巴比妥钠麻醉，麻醉后将大鼠四肢皮下插入针灸针，连接肢导联，记录肢体Ⅱ导联心电图，待心电图稳定后腹腔注射ISO（第三次），测定大鼠注射ISO 后5、15、30、60、180、300、600、900 s二导联心电图的ST 段[9]。

1.2.4 大鼠血流动力学及心肌力学的测定 心电图检测后将大鼠颈部正中切开皮肤，将事先充满0.3%肝素钠生理盐水的留置针通过左侧颈总动脉，插到左心室，连接多道生理记录仪，检测是否插管成功[10]。成功后腹腔注射ISO（第三次）并记录左室内压最大上升/下降速率（± dp/dtmax）。

1.2.5 大鼠血清LDH、CK、MDA、SOD 的测定

在大鼠心电图和血流动力学测定后腹主动脉取血，收集血液，于4℃静置，离心（5 min，2 000 r/min），取血清分装，置-80℃冰箱备用，按照试剂盒说明进行检测。

1.2.6 统计学方法用SPSS 22.0 进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析。以P＜ 0.05 为差异具有统计学意义。1.2.7 模糊综合评判法 确定评价指标、评语等级集和各指标评价等级标准范围，建立因素的权重集与评价因素之间的模糊关系，根据数学模型[11]，B =W*R 评判结果，建立评价因素的模糊关系矩阵。通过综合评分Y = B*C，得到综合评分结果。

2 结果与分析

2.1 对大鼠心电图ST 段变化的影响

与正常组相比，模型组ST 段升高（P＜ 0.05），表明造模成功。与模型组比较，各给药组均能降低ST 段变化（P＜ 0.05），各给药组与阳性药物组相比、微波加热组与传统加热组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），说明微波加热没有改变药效，具体见表1。

表1 造模后不同时间点大鼠ST 段的变化情况（mv，n = 10，±s）Tab. 1 Changes in ST segment of rats at different time points after modeling（mv，n = 10，±s）

表1 造模后不同时间点大鼠ST 段的变化情况（mv，n = 10，±s）Tab. 1 Changes in ST segment of rats at different time points after modeling（mv，n = 10，±s）

注：同列字母完全不同，表示差异有统计学意义，P ＜ 0.05，下表同。

组别 5 S 15 S 30 S 60 S 180 S 300 S 600 S 900 S正常组 0.04 ± 0.03a 0.02 ± 0.01a 0.03 ± 0.03a 0.05 ± 0.03a 0.05 ± 0.03a 0.09 ± 0.07a 0.05 ± 0.03a 0.06 ± 0.04a模型组 0.17 ± 0.05b 0.20 ± 0.05b 0.21 ± 0.03b 0.21 ± 0.04b 0.19 ± 0.05b 0.20 ± 0.05b 0.18 ± 0.03b 0.16 ± 0.04b阳性药物组 0.06 ± 0.07a 0.06 ± 0.08a 0.04 ± 0.04a 0.04 ± 0.03a 0.05 ± 0.05a 0.06 ± 0.03a 0.03 ± 0.02a 0.09 ± 0.07a微波加热组 0.05 ± 0.03a 0.05 ± 0.03a 0.02 ± 0.02a 0.01 ± 0.01a 0.03 ± 0.05a 0.06 ± 0.05a 0.05 ± 0.03a 0.06 ± 0.07a传统加热组 0.03 ± 0.05a 0.04 ± 0.04a 0.06 ± 0.04a 0.02 ± 0.02a 0.04 ± 0.07a 0.03 ± 0.04a 0.04 ± 0.07a 0.02 ± 0.04a F 8.285 12.920 27.227 42.811 9.001 8.856 11.499 4.372 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.011

2.2 不同提取方式对大鼠血流动力学的影响

模型组在注射ISO 后各时间点，与正常组相比-dp/dtmax 升高（P＜ 0.05），+dp/dtmax 降低（P＜0.05），表明大鼠在造模后心肌收缩、舒张功能受损。与模型组比较，各给药组-dp/dtmax 降低（P＜ 0.05）、+dp/dtmax 升高（P＜ 0.05），各给药组与阳性药物组相比、微波加热组与传统加热组相比，差异无统计学意义（P＞ 0.05），说明各给药组均能改善心肌收缩、舒张功能，微波加热并没有改变药效，具体见表2、3。

表2 造模后不同时间点大鼠左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)的变化情况（mmHg，n = 10，±s）Tab. 2 Changes in the maximum rate of increase of left ventricular pressure (+dp/dtmax) in rats at different time points after modeling（mmHg，n = 10，±s）

表2 造模后不同时间点大鼠左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)的变化情况（mmHg，n = 10，±s）Tab. 2 Changes in the maximum rate of increase of left ventricular pressure (+dp/dtmax) in rats at different time points after modeling（mmHg，n = 10，±s）

组别 5 S 15 S 30 S 60 S 180 S 300 S 900 S正常组 10 062.87 ± 2 487.67a 11 254.58 ± 2 041.36a 10 385.13 ± 1 662.76a 11 111.45 ± 1 707.96a 11 003.72 ± 1 380.70a 10 844.73 ± 983.49a 11 237.79 ± 1 362.43a模型组 7 052.25 ± 2 055.71b 6 837.46 ± 894.95b 7 443.18 ± 306.84b 6 790.77 ± 868.09b 6 784.36 ± 1 560.69b 7 564.29 ± 708.22b 7 832.34 ± 2 773.65b阳性药物组 10 513.00 ± 1 627.81a 10 170.59 ± 1 572.63a 10 405.58 ± 1 932.11a 10 766.60 ± 1 617.72a 11 223.75 ± 715.43a 10 835.98 ± 947.93a 11 800.23 ± 679.34a微波加热组 9 786.68 ± 1 512.06a 10 082.09 ± 1 705.63a 10 760.19 ± 1 731.07a 10 805.97 ± 2 005.60a 11 029.97 ± 1 983.58a 11 011.35 ± 1 432.33a 11 058.35 ± 1 142.46a传统加热组 10 156.86 ± 1 259.81a 10 234.99 ± 1 466.10a 10 326.23 ± 1 188.26a 9 357.30 ± 1 907.93a 10 014.04 ± 1 752.43a 10 808.41 ± 1 616.26a 11 109.92 ± 1 907.52a F 3.306 4.505 3.383 4.628 5.863 7.220 3.353 P 0.039 0.014 0.037 0.012 0.005 0.002 0.038

表3 造模后不同时间点大鼠左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)的变化情况（mmHg，n = 10，±s）Tab. 3 Changes in the maximum drop rate of left ventricular pressure (-dp/dtmax) in rats at different time points after modeling（mmHg，n = 10，±s）

表3 造模后不同时间点大鼠左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)的变化情况（mmHg，n = 10，±s）Tab. 3 Changes in the maximum drop rate of left ventricular pressure (-dp/dtmax) in rats at different time points after modeling（mmHg，n = 10，±s）

组别 5 S 15 S 30 S 60 S 180 S 300 S 900 S正常组 -6 991.37 ± 1 713.24a -7 751.46 ± 1 737.09a -7 843.63 ± 1 923.77a -8 234.86 ± 1 161.48a -8 671.26 ± 969.51a -8 158.87 ± 619.92a -9 421.39 ± 1 676.20a模型组 -3 991.46 ± 1 119.39b -4 172.97 ± 545.89b -3 896.48 ± 478.60b -3 665.77 ± 840.41b -4 442.75 ± 891.17b -5 159.51 ± 430.16b -4 631.96 ± 1 505.10b阳性药物组-7 155.15 ± 2 353.54a -7 256.77 ± 2 341.13a -7 316.89 ± 2 442.70a -7 038.57 ± 2 692.42a -7 902.53 ± 2 393.37a -7 069.50 ± 2 206.22a -8 725.28 ± 2 334.10a微波加热组-6 803.89 ± 447.18a -7 335.82 ± 638.83a -7 484.74 ± 660.83a -7 378.54 ± 1 043.99a -7 050.78 ± 1 596.22a -7 734.38 ± 796.43a -7 790.83 ± 1 391.86a传统加热组-7 399.60 ± 1 122.44a -7 588.50 ± 838.51a -6 871.03 ± 835.94a -6 307.37 ± 1 354.32a -7 264.71 ± 2 097.73a -7 335.51 ± 1 653.14a -7 678.83 ± 1 885.14a F 3.481 4.502 4.619 4.963 3.538 3.441 3.566 P 0.033 0.014 0.012 0.009 0.032 0.035 0.031

2.3 对大鼠血清LDH、CK、MDA、SOD 的影响

模型组血清中LDH、CK、MDA 含量高于正常组（P＜ 0.05），SOD 含量低于正常组（P＜ 0.05）。其它各给药组LDH、CK、MDA 含量低于模型组（P＜ 0.05），SOD 的含量高于模型组（P＜ 0.05），各给药组与阳性药物组相比、微波加热组与传统加热组相比，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。说明各给药组对心肌组织具有保护作用，微波加热没有改变药效，具体见表4。

表4 丹参不同提取方法对大鼠血清中LDH、CK、SOD、MDA 的影响（n = 10，±s）Tab. 4 Effects of different extraction methods of Salvia miltiorrhiza on LDH, CK, SOD and MDA in rat serum（n = 10，±s）

表4 丹参不同提取方法对大鼠血清中LDH、CK、SOD、MDA 的影响（n = 10，±s）Tab. 4 Effects of different extraction methods of Salvia miltiorrhiza on LDH, CK, SOD and MDA in rat serum（n = 10，±s）

组别 剂量/ （mg/kg） LDH /（U/L） CK /（U/mL） SOD /（U/mL） MDA /（nmol/mL）正常组 - 3 118.59 ± 1 223.58a 9.76 ± 2.30a 252.10 ± 14.27a 3.12 ± 0.38a模型组 - 4 628.97 ± 726.01b 12.63 ± 2.81b 205.57 ± 38.89b 6.26 ± 1.67b阳性药物组 0.6 2 928.66 ± 809.53a 9.92 ± 2.13a 252.50 ± 19.88a 4.19 ± 0.30a微波加热组 5.4 3 373.66 ± 1 330.80a 8.16 ± 1.57a 240.07 ± 29.72a 4.47 ± 0.82a传统加热组 5.4 3 657.12 ± 1 435.03a 8.80 ± 0.93a 229.66 ± 23.63a 4.68 ± 0.85a F 3.024 4.182 3.441 8.693 P 0.042 0.010 0.023 0.000

2.4 模糊综合评判法结果

2.4.1 确定评价指标U U = {u1, u2, …, u7} = {ST段、+ dp/dtmax,…,MDA}

2.4.2 确定评语等级集V V = {v1, v2, v3, v4} ={好、较好、一般、差}

2.4.3 确定各指标评价等级标准范围根据各指标的均数、频数分布确定等级范围见表5。

表5 各指标评价等级标准范围Tab. 5 The scope of the evaluation grade standard of each index

2.4.4 建立因素的权重集 采用上述的层次分析法所获得的权重系数来建立因素的权重集。

2.4.5 建立评价因素的模糊关系 根据急性心肌缺血实验所获得的各项指标的实测值在其评价等级范围内的频数分布建立模糊关系。

2.4.6 模糊综合评价 根据数学模型，B=W*R 评判结果，其中，W 为各指标权重组成的向量，R 为各指标隶属度向量组成的矩阵，B 为综合评判的结果向量，按照最大隶属度原则分别对不同加热方式产生的药效结果进行综合评价。根据各评价因素对药效的影响程度，采用强制决定法[12]，确定各评价因素权重分别为ST 段（0.2）、+dp/dtmax（0.2）、-dp/dtmax（0.2）、急性心肌缺血（0.4）。因此，W={0.2、0.2、0.2、0.4}。

建立评价因素的模糊关系矩阵。

根据公式B = W*R 可得：

B微波= （0.317，0.525，0.117，0.050）

B传统= （0.464，0.350，0.117，0.050）

为了更好的评价药效，我们选择各分数区间的中值作为等级的参数，则参数项为CST段= {0.03，0.09，0.15，0.21}，C+dp/dtmax= {5 068.52，9 650.26，8 460.7，7 343.14}，C-dp/dtmax= {-3 991.25，-7 263.05，-5 824.14，-4 385.23}，CLDH= {2 523.5，3 332.5，4 141.5，4 950.5}，CCK= {7.7，9.9，12.11，14.32}，CSOD= {258，232，206，180}，CMDA= {4.395，5.405，6.415，7.425}。综合评分Y = B*C，结果见表6。通过对7 个药效指标进行综合评分，微波加热药效的综合评分均大于传统加热药效的综合评分。

表 6 不同加热方式丹参药效的综合评分Tab. 6 Comprehensive scores of Salvia miltiorrhiza with different heating methods

3 讨论

据清代《本草逢源》记载，丹参具有“活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈”等功效[13]。现代药理学研究表明丹参对心肌缺血具有保护作用，因此本实验采用腹腔注射盐酸异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血，异丙肾上腺素可以兴奋心脏，增强心肌功能，连续大剂量注射使心肌耗氧增加，大鼠由于心肌供氧不足引起心肌能量代谢障碍导致心电图ST 段产生抬高或压低的异常变化，导致左心室缩/舒功能异常，其中，左室内压最大上升/下降速率（±dp/dtmax）可以反映心肌收缩和舒张能力的变化情况。由于心肌组织处于缺血缺氧状态，心肌细胞受损，LDH、CK 外漏，导致血液中LDH、CK 含量增加，氧自由基增加，导致消除自由基SOD 的减少，过氧化物MDA 的增多[14]。所以本实验通过大鼠心电图ST 段变化，血流动力学指标、心肌酶等多指标进行考察，比较不同加热模式下丹参提取物药效的差异性。

结果表明，不同加热模式下丹参提取物均能降低大鼠心电图ST 段，能够改善大鼠的收缩与舒张功能，具有清除氧自由基、抑制氧自由基的产生和过脂质化的作用，抑制血清中CK、LDH 活性的升高从而保护心肌组织。将药效数据进行统计分析后，各药效指标结果都表明不同加热模式下丹参提取物能改善大鼠心肌缺血的症状，但是不同加热模式之间药效差异无统计学意义，说明微波加热不会改变丹参原有的药效。

进一步通过模糊综合评判法将药效指标的定性评价转化为定量评价[15-16]，从7 种药效评分表中可以直观地看出微波加热的药效综合评分大于传统加热的药效评分，可见微波加热的药效强度大于传统加热的药效强度。这与课题组前期研究[17]发现的微波提取的化学成分在种类上没有差异，但是丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮 Ⅱ A 的含量均大于传统提取的含量的结果相一致。

4 结论

本研究以大鼠急性心肌缺血为药效模型来考察微波加热对丹参提取物药效的影响，结果表明微波加热不会改变药效，并且能够在一定程度上增加药效强度。由于本次实验采用的工艺参数为传统加热的最优工艺参数，提取时间长，传统加热与微波加热的有效成分都提取完全，药效强度差异较小。建议后续从提取动力学角度研究，比较传统加热与微波加热提取动力学的差异性。本研究为微波提取技术在中药大工业生产以及中药微波提取物在临床的广泛应用提供参考。