温岭市宫颈炎患者HPV E6/E7 DNA基因分型检测及分子流行病学调查

张婷 李蒙佳 陈瑛 郭洁洁

人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一类球形双链DNA 病毒，感染后能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，主要通过性传播和密切接触的方式感染人类。目前已经报道的HPV 型别有200余种，根据侵犯的组织部位和临床表现分为低危型和高危型两大类[1，2]。HPV E6/E7 基因是主要的致癌基因，检测这两个基因具有灵敏、高效、实用、不易漏检等特点。流行病学调查显示，HPV 感染具有地域性、种族性和多样性的特点，此外，性生活、免疫功能缺陷或遗传变异等都会影响HPV 的流行[3，4]。由于不同地区HPV 感染的基因不尽相同，掌握本地区HPV 型别的感染情况和流行规律有利于女性宫颈癌预防和早期筛查。本次研究对就诊本院的2 293 例宫颈炎患者HPV E6/E7 进行检测，分析探讨本地区HPV 感染的分子流行病学特点，为临床诊治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020 年1 月至2021 年8 月于温岭市第一人民医院门诊就诊的宫颈炎患者2 293 例，收集其宫颈脱落细胞，年龄15～71 岁，中位年龄41.77 岁。患者纳入标准为：①符合宫颈炎诊断标准；②宫颈细胞学检查无癌前病变。排除标准为：①患有心、肝、肾或血液系统疾病；②精神疾病、结核病等；③妊娠期、哺乳期妇女。

1.2 方法 将宫颈炎患者宫颈脱落细胞保存液样本于涡旋混合仪上充分涡旋10 s，取1 ml 保存液样本于1.5 ml 离心管中，12 000 g 离心5 min，去掉上清液，吸取200 μl 核酸提取试剂加入到样品管中，然后将样品管放入100 ℃恒温金属浴中保温15 min，小心取出，以12 000 g 离心10 min，吸取9 μl 上清液进行聚合酶链反应扩增。扩增条件为：42 ℃5 min、94 ℃8 min；94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃1 min，共35 个循环；最后72 ℃1 min。

采用GenomeLab GeXP 遗传分析系统分析PCR扩增产物，包括18 种高危型别HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82 和7 种低危型别HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44、HPV81、HPV83。每个样本孔加入28.7 μl SLS 上样缓冲液、0.3 μl DNA Size Standard-400、1 μl PCR 产物和1 滴矿物油，将220 μl 分离缓冲液加入到96 孔分离液板的孔中，选择PCR 毛细管电泳法分离样本，使用“Default GeXP Analysis Parameters”方法分析样本。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0 统计软件。计数资料采用例（%）形式表示，组间比较采用χ2检验。设P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV 检测结果 2 293 份宫颈炎患者宫颈脱落细胞中共检出HPV 感染793份，总感染率为34.58%。年龄＜20 岁组HPV 感染率最高，为82.76%；年龄 在21～30岁 组HPV感染率为34.27%；年龄在31～40 岁 组HPV感染率为30.21%；年龄在41～50岁组HPV感染率为35.19%；年龄在51～60岁 组HPV感染率为35.97%；年龄＞60岁组HPV 感染率为58.33%。其中年龄＜20岁组HPV 感染率明显高于其他年龄组，差异有统计学意义（χ2=51.55，P＜0.05）。

2.2 HPV基因分型检测结果见表1

表1 793 例宫颈炎患者HPV基因分型检出率

由表1 可见，793 例HPV 感染的患者中，高危型占总基因型的81.77%，检出率前五位的是HPV52、HPV58、HPV16、HPV53 和HPV51。低危型HPV 感染占18.23%，以HPV81 检出率最高，其次是HPV42。

2.3 HPV感染类型分布和感染率见表2

表2 HPV感染类型分布和感染率

由表2 可见，793 例HPV 感染患者中，单一型别感 染527 例，占66.46%；多重感染266 例，占33.54%，其中以二重感染为主，二重感染又以HPV52+HPV58和HPV52+HPV16较为多见。

3 讨论

世界卫生组织和国际癌症研究学会根据HPV致癌危险性的高低将其分为低危型和高危型两大类，低危型HPV 主要引起低度宫颈上皮内瘤变和皮肤及外生殖道的外生性疣类病变；高危型HPV 除可引起生殖器疣外，更重要的是可引起宫颈癌、高度宫颈上皮内瘤变及外生殖器癌[5]。人类是HPV 的唯一宿主，可通过直接或间接接触污染品或性传播方式感染，大量的流行病学调查和实验室数据都表明，持续的高危型HPV 感染是诱发宫颈癌和癌前病变的最主要因素[6,7]。

本次研究中，温岭地区2 293 例门诊宫颈炎患者筛查出HPV感染率为34.58%，与湖州市女性宫颈炎患者HPV 感染率（33.91%）和哈尔滨市HPV 感染率（36.45%）相近[8,9]，但高于随机抽取的女性人群HPV 感染率（深圳为21.15%[5]、郑州为25.9%[10]、山西为14.8%[11]、襄阳为28.8%[12]、台湾南部为19.3%[13]）及受教育程度较高的女性医务工作者HPV 感染率（8.95%）[14]，明显低于北京地区女性宫颈组织学异常患者HPV 感染率（72.51%）[15]。由此可以看出选择不同人群调查研究其HPV 感染率波动较大，而且不同地区、文化程度、年龄和性伴侣的数量等都是影响HPV 感染率的潜在因素[16]，所以明确一个地区HPV 流行的感染率，对本地区女性生殖道疾病和宫颈癌的预防具有重要意义。HPV 感染会呈现两个高峰期，第一个高峰期出现在年龄＜20 岁或＜25 岁，随年龄的增长呈下降趋势，这可能与性生活活跃有关，第二个高峰期出现在年龄＞60 岁，这可能与HPV 持续感染有关[17,18]。本次研究中观察到两个高峰年龄段，感染率较高，同文献报道一致，但未发现感染率下降的趋势，可能与研究对象的筛选有关，本次研究对象主要来自门诊宫颈炎患者，其HPV感染率可能高于随机抽取女性人群。

流行病学调查显示，HPV 感染具有地域性特征，不同地区所流行的主要型别不尽相同，其中HPV16 是世界范围内最为常见的型别，其他优势型别欧洲为HPV31 和HPV52、南美洲为HPV58、亚洲地区为HPV58 和HPV52[19]。何健方等[8]研究发现湖州地区位于前4 位的HPV 亚型依次为HPV16、HPV58、HPV18、HPV56；义乌地区主要为HPV16、HPV58、HPV18、HPV33[20]。一项来自广西的研究显示其地区的主要型别为HPV52、HPV16、HPV58、HPV51、HPV53[19]。值得注意的是，虽然本次研究所在地区与湖州、义乌属同一个省份，但HPV 感染的型别却不尽相同，尤其是本市的优势型别中没有HPV18，说明HPV18 并不是引起本市宫颈癌的主要原因，考虑可能与本地区流动人口较多、性生活频繁、初次性生活年龄较小或样本量有关，虽然国内九价疫苗已上市，但未覆盖HPV53 和HPV51，今后的疫苗研发需重视这两种型别的覆盖，保护更多的人群。

由于HPV 的不同亚型其编码的外壳蛋白的基因变异很大，不同的亚型之间基本无交叉免疫保护作用，很容易造成HPV 的多重感染和多次感染。本次研究中HPV 单一感染率较高，为66.46%，多重感染率占33.54%，多重感染以二重感染和三重感染为主，最低为七重感染，且仅检出2 例。近年来我国HPV 多重感染率在逐年增加[12]，因为HPV 多重型别感染病毒载量高于单一型别感染，其致病风险相当于单一感染风险的1.6 倍。病毒载量越高，则需要自身清除的时间越长，HPV 持续感染的概率增加，致病能力显著提高，宫颈病变的风险也会随之提高。本研究中二重感染以HPV52+HPV58 和HPV52+HPV16 较为多见，明确本地区多重感染基因型对早期筛查和诊治有重要作用，为后续跟踪随访提供理论依据。

HPV 是目前人类所有癌症病变中较为明确的致病因子，宫颈癌也是少有的已经明确病因的肿瘤之一[21]。如果患者检测出HPV 高危型持续感染，尤其伴有HPV16或HPV18亚型，需要定期对患者进行阴道镜检查和宫颈活检。由于育龄妇女是HPV 感染的易感人群，HPV 感染非常常见，故应对育龄期妇女进行常规的HPV DNA 检测，并通过细胞学检查、阴道镜检查和宫颈活检等技术尽早阻止癌前病变的发生，提高广大妇女的生活质量。宫颈癌的发生发展是一个从量变到质变的过程，早发现、早诊断和早治疗可降低发病率和死亡率，HPV 基因分型检测是预防宫颈癌的有效途径，将在宫颈疾病的筛查和防治中发挥重要的作用。一个地区HPV 基因流行谱的建立，可为疫苗的选择提供理论依据。本次研究还未涉及男性的HPV 感染的流行病学调查，将是未来研究的方向。