碱性成纤维细胞生长因子对高胆红素血症新生SD大鼠脑组织Bcl-2、Bax表达的影响

程 皓，阴怀清，王 娟，史瑞玲

高胆红素血症是新生儿期常见的疾病，主要是由于胆红素合成与清除生理不平衡所致。某些情况下，循环胆红素水平升高导致急性胆红素脑病、慢性胆红素脑病及大脑皮层下结构的永久性神经损伤，早期通过合理喂养、蓝光照射或换血等治疗可降低血清胆红素水平，但仍缺乏有效的干预挽救胆红素所致脑病的神经细胞损伤，从而导致神经发育异常，遗留智力低下、听力障碍、癫痫、脑性瘫痪或自闭等后遗症，严重者出现死亡[1-2]。本研究通过对7 d龄新生SD(Sprague Dawley)大鼠腹腔注射胆红素溶液建立高胆红素血症模型，探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能否促进高胆红素血症所致脑组织神经细胞损伤的修复，观察其对神经细胞Bcl-2、Bax表达的影响，从而阐明bFGF可能的脑保护机制，为临床防治胆红素脑病提供理论依据[3]。

1 材料与方法

1.1 实验材料 胆红素购自美国MCE公司，注射用bFGF、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Tunnel)试剂盒-POD(MK10235)、一抗(Rabbit Anti-Bcl-2、Rabbit Anti-Bax)、二抗(SA1022-兔IgG SABC免疫组化染色试剂盒)购自武汉博士德生物技术公司。柠檬酸缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)的抗原修复液、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、二氨基联苯胺法(DAB)显色试剂盒等由山西医科大学第一医院病理科提供。

1.2 动物模型建立

1.2.1 实验动物 新生7 d龄的健康清洁级SD大鼠120只(由山西医科大学实验动物中心提供)，体质量10.8～16.2 g，雌雄不限，随机按窝系、体质量分为3组：正常空白对照组(CG组)、高胆红素血症组(EG1组)和bFGF干预组(EG2组)，每组40只大鼠。

1.2.2 胆红素溶液制备 电子天平避光情况下称取胆红素晶体50 mg，取1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液溶解，量取9 mL双蒸水倒入，使用0.5 mol/L的稀盐酸溶液调节pH值至8.5，得到浓度为5 mg/mL胆红素溶液，遮光存放，于1 h内使用。

1.2.3 动物模型制作 参照文献[4]将胆红素溶液按照100 μg/g注入EG1组、EG2组SD大鼠腹腔中，CG组大鼠腹腔注射等体积生理盐水，余条件相同(温度、湿度适宜的环境中母鼠哺育)。

1.2.4 动物模型鉴定 肉眼观察大鼠是否出现异常神经行为，包括活动减少、烦躁、翻滚、俯伏、肢体阵发性痉挛、对外界刺激的逃避反应减弱等。

1.3 bFGF治疗方法 高胆红素血症动物模型建立后30 min，EG2组大鼠腹腔注射bFGF溶液，CG组、EG1组大鼠腹腔注射等体积生理盐水。

1.4 实验方法

1.4.1 标本采集 将各组新生SD大鼠于6 h、12 h、24 h、48 h、72 h麻醉(5%水合氯醛0.02 mL腹腔注射)，固定于手术台上，灌洗(暴露心脏、肝脏，肝右叶剪一4 mm左右切口，使用皮试针由心脏搏动明显处注入无菌生理盐水和10%甲醛溶液，直至肝右叶流出的液体清亮，可见大鼠口唇、颈部、面色苍白)，断头后使用镊子等钝性分离取脑组织，置于10%甲醛溶液中固定约24 h，送至病理科，选取视交叉及其后5 mm处石蜡包埋。

1.4.2 观察指标 冠状切片行苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察海马区神经细胞形态结构；免疫组化检测与HE染色相邻的切片Bcl-2及Bax表达，Tunnel法检测细胞凋亡率。实验流程按试剂盒说明书进行操作。

1.4.3 数据采集 应用美国Aperio公司病理切片扫描成像系统，测定所选海马区域内所有Bcl-2/Bax免疫阳性细胞灰度值，每张切片标本随机选取4个视野(×400)，经病理切片扫描成像系统处理(扫描、取图和分析)，得到选定视野单位面积灰度值的平均值及标准差，其中免疫细胞阳性表达与平均灰度值呈负相关(即logA/B，A=240，B=灰度值)。海马区域内神经细胞凋亡数量应用Tunnel法检测，计算凋亡率，取平均值。

2 结 果

2.1 大鼠一般行为观察 模型建立后，CG组大鼠几乎未见异常神经行为，EG1、EG2组建模6 h后部分大鼠出现神经异常改变，24 h后有烦躁、活动减少、呼吸急促，规避外界刺激反应减弱，可见翻滚、抽搐、震颤、俯伏，其中俯伏现象多见。随着时间延长症状逐渐加重，EG2组大鼠各时间点均较EG1组神经行为异常改变轻微，EG1组大鼠死亡1只(死亡样本由同批次建立的预备模型大鼠补充)。

2.2 脑标本大体观察 EG1组、EG2组新生SD大鼠海马区、小脑可见散在黄染程度不同的区域。

2.3 HE染色结果 CG组海马区可见神经元排列整齐，细胞结构清楚，形态正常，小泡密集。EG1组神经细胞胞体及胞核固缩，部分细胞核破裂、溶解、消失，小胶质细胞及少突胶质细胞增多。EG2组神经细胞细胞核形态欠规则，膜结构皱缩、破裂较EG1组减少，小胶质细胞及少突胶质细胞未见减少。详见图1。

图1 各组不同时间新生SD大鼠海马区病理图(HE，×400)

2.4 bFGF对神经细胞Bcl-2/Bax表达的影响 免疫组化检测神经细胞免疫阳性表达，镜下可见棕黄色颗粒。

2.4.1 Bcl-2 CG组Bcl-2阳性表达极少；EG1组于6 h可见增加，24 h、48 h渐增，72 h达高峰；EG2组同时间点Bcl-2阳性表达较EG1组明显增多，且均多于CG组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图2。

表1 各组不同时间Bcl-2表达灰度值比较(±s)

图2 各组不同时间新生SD大鼠海马区Bcl-2表达免疫组化图(DAB，×400)

2.4.2 Bax CG组Bax阳性表达极少；EG1组于6 h增加，之后逐渐增多，72 h达高峰；EG2组同时间Bax阳性表达较EG1组减少，但多于CG组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图3。

表2 各组不同时间Bax表达灰度值比较(±s)

图3 各组不同时间新生SD大鼠海马区Bax表达免疫组化图(DAB，×400)

2.5 各组不同时间神经细胞凋亡情况比较 CG组凋亡细胞极少，EG1组6 h可见凋亡细胞，之后凋亡细胞逐渐增多，同时间EG1组凋亡细胞多，EG2组凋亡细胞少，但均多于CG组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3、图4。

表3 各组不同时间神经细胞凋亡情况比较(±s) 单位：%

图4 各组不同时间SD新生大鼠海马区细胞凋亡显微镜图(DAB，×400)

3 讨 论

黄疸是新生儿时期普遍存在的一种良性疾病，是新生儿正常生长发育过程中出现的症状，主要临床表现为巩膜黄染及皮肤黏膜黄染，也是某些疾病的表现，是新生儿出生1周后住院的主要原因。胆红素产生多(新生儿脱离宫内低氧环境适应外界，体内相对较多的红细胞被破坏及新生儿红细胞寿命本身较短)、代谢不平衡(新生儿时期肝细胞功能不成熟，结合、摄取及排泄胆红素能力低下)引起血清非结合胆红素(UCB)水平增加[5]，临床表现为黄疸。相关研究显示，脑组织中UCB作用具有双面性，适合浓度的UCB是一种有效的抗氧化剂，其能提供共轭双键和活性氢原子清除活性氧和活性氮等细胞毒性自由基，然而发生高胆红素血症时血清UCB达到神经毒性浓度，形成稳定的胆红素自由基，导致脂质过氧化损伤，破坏的生物膜主要是细胞膜及线粒体膜，引起细胞吞噬、细胞间信号识别障碍甚至出现细胞凋亡；UCB可刺激促炎因子释放；UCB引起髓鞘碱性蛋白丢失，导致髓鞘形成不足；由神经营养因子及神经生长因子诱导的促生存信号激活可被UCB抑制；UCB可激活Caspase-3、Bcl-2、Bax凋亡蛋白，导致神经细胞凋亡，造成中枢神经系统不可逆损伤，即胆红素脑病[6-7]。有研究显示，7 d龄SD大鼠脑发育组织学与人类妊娠32～34周早产儿相似[8]。

本研究将bFGF溶液经腹腔注射于7 d龄SD大鼠建立高胆红素血症模型。高胆红素血症脑损伤后神经细胞凋亡由Bcl-2基因家族控制，根据结构同源性分为3类：抗凋亡蛋白(包括Bcl-2)、促凋亡蛋白(包括Bax和Bak)及bh3蛋白。Bcl-2蛋白通过阻止线粒体破坏及之后释放的细胞色素C和Caspase激活抑制细胞凋亡；细胞死亡信号引起促凋亡蛋白Bax发生构象改变，进入并聚集于线粒体外膜，导致线粒体外膜通透性增加，致使其丧失正常功能并释放凋亡因子，最终发生细胞凋亡[9-10]，造成不可逆损伤。本研究结果显示，与CG组比较，各组间Bcl-2和Bax表达均升高，其中EG1组6 h即出现神经细胞Bcl-2阳性表达增多，之后表达持续增多，于72 h稳定高值；神经细胞Bax阳性表达呈升高趋势，72 h达高峰；Tunnel法测定的凋亡指数与Bcl-2、Bax增加趋势一致，证实了Bcl-2的抗凋亡作用及Bax的促细胞凋亡作用。

bFGF在中枢神经系统高表达，对不同中枢神经系统疾病具有神经细胞的保护和促修复作用。黄俊杰等[11]研究显示，bFGF可促进血管内皮细胞有丝分裂及血管增生，扩张血管，增加脑损伤部位血流量，改善缺血缺氧，氧自由基生成量减少；缺血缺氧导致脑损伤，增加该区域血脑屏障通透性，bFGF能穿透血脑屏障进入脑组织与神经细胞膜上bFGF受体结合，降低Bax/Bcl-2转录比值，神经细胞凋亡被抑制，使凋亡相关基因的表达受到影响，从而保护神经细胞。有研究显示，在全脑缺血/再灌注损伤中，bFGF通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径抑制过度自噬，并通过阻止线粒体p53易位抑制细胞凋亡，在海马CA1区域保护神经细胞，改善大脑功能[12-13]。bFGF是一种分泌蛋白，属于成纤维细胞生长因子(FGF)家族，几乎在每个组织均有表达，在生理和病理条件下参与细胞增殖、分化、迁移，血管生成和细胞存活[14]。

目前已鉴别出22种FGF配体，按照结构和功能相似性分为几个亚科，与4个FGF膜结合受体之一结合，信号机制与RAS/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酶y(PLCy)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)相近[15]。本研究观察bFGF抗神经细胞凋亡的作用，与CG组相比，EG1组和EG2组Bcl-2表达增加，Bax表达减少，海马区神经细胞凋亡指数减少。提示bFGF对血清高浓度胆红素造成的神经细胞损伤有一定的保护作用，为胆红素脑病的靶向治疗提供了新方向。

综上所述，bFGF对高胆红素血症所致的脑损伤具有保护作用，可抑制神经细胞凋亡，修复损伤的神经细胞，为新生儿高胆红素血症的临床防治提供新思路。