羧甲司坦L-精氨酸盐的合成及其对支气管上皮细胞的保护作用

2022-05-09吴建兵张奕华黄张建

中国药科大学学报 2022年2期

贾健，吴建兵，张奕华，黄张建

（中国药科大学新药研究中心，南京 210009）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo‑nary diseases，COPD）是一种常见的慢性气道疾病，具有高发病率、致残率和致死率的特点［1-4］。据报道我国20 岁及以上成人COPD 患病率为8.6%，40 岁以上人群患病率高达13.7%，提示我国COPD发病率呈现高态势［5-7］。吸烟是造成COPD 最主要的原因，80% ~ 90%的COPD 患者都与吸烟密切相关［8-10］。

羧甲司坦（carboxymethylcysteine，CMC）是临床常用的黏痰溶解药。临床研究发现，应用CMC可明显减少COPD 患者病情急性加重并延长发作间歇［11-12］。CMC 治疗COPD 的疗效不仅与其黏液溶解性有关，更多地与其抗氧化、抗炎作用相关［13］。CMC 还可通过抑制促炎因子白细胞介素1β、白细胞介素6 及肿瘤坏死因子α 等的生成，减少炎性介质的释放，减轻体内的炎性反应［14-16］。遗憾的是，CMC 化学结构中的两个羧酸基导致该药物对消化道有刺激作用，可引起胃部不适、恶心、呕吐、肠胃道出血等不良反应。

L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）是一种半必需氨基酸，可被内源性NOS 代谢为NO 和瓜氨酸，在维持气道张力和功能方面起着重要作用。值得一提的是，只有L-精氨酸才能作为NOS 的底物释放NO，而D-精氨酸不具有产生NO 的能力［17-18］。NO缺乏也被证明是COPD、哮喘和囊性肺纤维化患者肺功能恶化的原因之一［19-21］。在胃肠道系统中，NO 可通过抑制胃酸分泌、促进胃黏液分泌、调节黏膜血流量等发挥胃肠道保护作用［22-27］。传统非甾体抗炎药（NSAIDs）具有严重胃肠道不良反应，而NO 供体型NSAIDs（NO-NSAIDs）如阿司匹林L-精氨酸盐、NO-阿司匹林、NO-布洛芬等不仅具有强效的抗炎、镇痛作用而且具有NO 介导的胃肠道和心血管保护作用［28-33］。

基于上述背景，本研究设计、合成了一种CMC的L-精氨酸盐化合物（CMCA），并测试了CMCA 的理化性质及其在人支气管上皮细胞（16-HBE）中抗氧化、抗凋亡和NO释放的作用。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

羧甲司坦（成都西亚化工股份有限公司，Lot：20200710）；L-精氨酸［梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，Lot：22RPO］；商用卷烟（万宝路红标）；16-HBE 细胞系、DCFH-DA 活性氧检测试剂盒、Annexin V-APC/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒、DAF-FM DA 一氧化氮检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；6 孔培养板（美国Corning Costar 公司）；AV-500 核磁共振仪（德国Bruker 公司）；MAT95XP 型高分辨质谱仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；X-4 精密显微熔点测定仪（北京福凯仪器有限公司）；pH 计［梅特勒-托利多（中国）有限公司］；FACS Calibur流式细胞仪（美国Becton-Dickinson公司）。

1.2 CMCA的制备与表征

CMCA 的合成途径如路线1 所示，将L-精氨酸（1.74 g，10 mmol）溶于蒸馏水5 mL 中，逐量加入CMC（1.79 g，10 mmol）始终保持反应液为澄清状，于室温25 ℃下搅拌2 h，向反应液中滴加无水乙醇50 mL，开始时滴速稍快，至有白色晶体析出时减慢滴速，滴毕，搅拌0.5 h，抽滤，用少量乙醇洗涤滤饼，40 ℃真空干燥，得白色CMCA结晶3.20 g，收率约90.7%。mp 203.8 ~ 205.2 ℃；UV（H2O）λmax211.5（lg ε 3.717）nm；IR（KBr，ν）：918.6，1 223.9，1 380.0，1 690.7，3 336.9，3 438.0 cm-1；MS（m/z）：175［M2+H］+，178［M1-H］-；1H NMR（500 MHz，D2O）：δ1.86 ~1.66（2H，m），2.04 ~1.91（2H，m），3.11（1H，dd，J1= 14.6，J2= 8.5 Hz），3.23（1H，d，J=14.8 Hz），3.31（2H，t，J= 6.6 Hz），3.39（2H，s），3.84（1H，t，J=5.7 Hz），3.98（1H，d，J=6.6 Hz）；13C NMR（125 MHz，D2O）：δ175.38，172.13，170.66，52.20，51.61，38.37，34.83，31.33，25.39，21.75。

Scheme 1 Synthetic route of carboxymethylcysteine L-arginate(CMCA)

1.3 香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）的制备及模型的建立

香烟烟雾溶液的制备方法如文献所述［34］。在真空烧瓶中每25 mL PBS 使用一支香烟燃烧5 min以生成CSE-PBS 溶液。再使用0.22 μm 孔径的过滤器过滤CSE 溶液，以去除细菌和大颗粒。然后将烟雾溶液的pH 调节至7.4，其溶液设为100%CSE，并在每次实验中稀释至所需浓度。

本研究采用16-HBE 细胞系建立CSE 模型，参照文献方法［35］所述，将受试药物与16-HBE 细胞预孵育1 h 后，加入10%CSE 继续孵育18 h。每组实验重复进行3次。

1.4 DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧含量

DCFH-DA 是一种被广泛用于检测ROS 的荧光探针。用PBS 洗涤细胞1 次（离心200 r/min，5 min）收集并调整细胞浓度为每毫升1× 106个细胞，按照1∶1 000 用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA 中，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每3~5 分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触，用无血清细胞培养液洗涤细胞3 次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。用流式细胞仪检测（λEx=488 nm；λEm=530 nm）细胞内的活性氧。

1.5 Annexin-V APC/7-AAD双染法检测细胞凋亡

将对数生长期的16-HBE 细胞接种到6 孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别设置相应的含药培养基，同时设立阴性对照组。药物作用18 h后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集细胞，用PBS 洗涤细胞两次（离心200 r/min，5 min）调整细胞浓度为每毫升5×105个，加入结合缓冲液500 μL悬浮细胞，加入Annexin V-APC 5 μL 混匀后，再加入7-AAD 5 μL 混匀，室温、避光、反应5 ~ 15 min。使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 DAF-FM DA荧光探针检测细胞内NO含量

DAF-FM DA 是一种可用于检测细胞内低浓度NO 的荧光探针。将细胞消化、计数、配制成浓度为每毫升5 × 104个细胞的细胞悬液，接种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别设置加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组。加药18 h 后，用0.25%胰酶消化收集细胞，用PBS 洗涤细胞1 次（离心200 r/min ，5 min）收集并调整细胞浓度为每毫升1 × 106个。按照1∶1 000 用无血清培养液稀释DAF-FM DA，使终浓度为5 μmol/L，细胞收集后悬浮于稀释好的DAF-FM DA 中，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，每3 ~ 5 分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3 次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA；用流式细胞仪检测（λEx= 495 nm；λEm=515 nm）细胞内NO 的情况。

1.7 统计学处理

计量数据以平均数±标准差（±s）表示，P＜0.05 认为有显著性差异。两组间统计学差异采用Tukey's 检验，多组间数据使用单因素方差分析（One-Way ANOVA）分析检验。所有分析和绘图均使用统计软件GraphPad Prism 8。

2 结果

2.1 CMCA改善CMC的理化性质

将CMC 与CMCA 配制成为1 mg/mL 的水溶液，使用pH 计测试二者pH，结果如表1 所示，CMCA 改善了CMC 自身的强酸性。以脂水分配系数lgP作为评价指标，采用分配系数（正辛醇-水）摇瓶法试验，结果如表1 所示，CMCA 的亲水性较CMC好。

Table 1 pH and lg P of CMC and CMCA(± s,n = 3)

CMC:Carboxymethylcysteine;CMCA:Carboxymethylcysteine L-arginate

Compd.CMC CMCA pH 2.18±0.67 4.22±0.25 RSD 30.47 5.92 lg P-1.47±0.09-2.03±0.31 RSD-6.05-15.05

2.2 CMCA 抑制CSE 引起的16-HBE 细胞内的ROS积聚

首先，本研究测试了CMCA 清除CSE 诱导16-HBE 细胞内ROS 的能力，以证明其抗氧化作用。如图1 所示，10%CSE 刺激18 h 后，16-HBE 细胞内产生大量ROS（P＜0.001）。通过给予1×10-4mol/L CMC 或L-精氨酸治疗后，与模型组相比ROS 的生成明显减少。采用不同浓度的CMCA 治疗后ROS的生成也显著降低，并呈现剂量依赖性关系，其中1×10-4mol/L 的CMCA 组ROS 蓄积程度最低，且低于等摩尔浓度的CMC 组（P＜0.001），与1 × 10-4mol/L L-精氨酸组相比无显著性差异。

Figure 1 Effect of CMCA on cigarette smoke extract（CSE）-induced reactive oxygen species(ROS)generation in 16-HBE cells(± s,n = 3)

2.3 CMCA抑制CSE引起的16-HBE细胞凋亡

CMCA 抑制CSE 引起的16-HBE 细胞凋亡情况见图2，10%CSE 刺激18 h 后，导致16-HBE 细胞大量凋亡（P＜0.001）。通过给予1 × 10-4mol/L CMC或1×10-4mol/L L-精氨酸治疗后，与模型组相比细胞凋亡情况明显好转。采用不同浓度的CMCA 治疗后能剂量依赖性的抑制细胞凋亡，其中1 × 10-4mol/L CMCA 治疗效果最佳，优于1 × 10-4mol/L CMC 组（P＜0.001）和1 × 10-4mol/L L-精氨酸组（P＜0.001）。

2.4 CMCA促进16-HBE细胞内NO的生成

为了验证NO 在16-HBE 细胞中发挥的作用，进一步研究了16-HBE 细胞内NO 的含量情况（图3），10% CSE 刺激后，16-HBE 细胞内NO 含量明显降低（P＜0.001）。通过给予1×10-4mol/L CMC 治疗后，细胞内NO 含量显著性增加（P＜0.001）。给予1 × 10-4mol/L CMCA 治疗后，细胞内NO 含量增加，显著多于模型组和1 × 10-4mol/L CMC 组（P＜0.001）。

3 结果与讨论

香烟烟雾中含有醛类、尼古丁类、氰化物、氧自由基、焦油等大量有害成分，可直接对气道和肺组织造成损伤，产生并释放TNF-α、IL-8 及IL-6 等炎症介质，促进气道炎症，是导致COPD 最主要的原因。CSE 从香烟烟雾中提取并溶于细胞培养基中，被广泛用于体外研究中［36-38］。支气管上皮细胞在协调COPD 病理进程中起着关键作用，刺激物首先与之接触引起气道和肺部的炎症反应，释放各种炎症介质和细胞因子，进而导致疾病加重和各种相关症状的产生［39］。本研究采用10%CSE 诱导支气管上皮细胞系16-HBE 病变，以模拟体外COPD 损伤。结果表明，模型组ROS 大量积聚，细胞发生明显凋亡，提示造模成功。

Figure 2 Effect of CMCA on CSE-induced 16-HBE cells apoptosis(± s,n = 3)

实验结果表明，CMCA 显著改善了CMC 本身的强酸性，从而可能减轻对消化道的刺激作用。此外，在等物质的量浓度下CMCA 较CMC 或L-精氨酸有着更好的清除ROS 和抗细胞凋亡的能力，并且呈现浓度依赖性关系，提示在体外CSE 诱导的细胞损伤模型中CMCA 较CMC 有着更好的治疗效果。

随后使用DAF-FM DA 荧光探针检测细胞内NO 的含量，考察CMCA 细胞保护作用是否依赖于NO。研究发现，模型组较对照组NO 含量显著下降，可能是由于10%CSE 的加入，使细胞内自身的NO 与CSE 刺激产生的ROS 进一步反应生成NO2、N2O3和ONOO-等其他活性氮形式，无法被荧光探针所检测。CMC 的加入，减轻细胞内炎症和抗氧化应激损伤，恢复细胞内部分NO 含量（P＜0.001vs模型组），而CMCA给药后细胞内NO含量进一步增加（P＜0.001vsCMC 组）。以上提示NO 对CSE诱导的细胞损伤可能具有保护作用。

总之，本研究合成的CMCA 较CMC 具有更优的理化性质，在体外CSE 诱导的细胞损伤模型中较CMC 有着更好的清除ROS 和抗细胞凋亡的作用。此外，CMCA 还可能降低应用CMC 带来的胃肠道不良反应，改善患者的依从性，较CMC具有更广泛的应用前景，值得深入研究。