膨化大豆替代鱼粉对杂交鲟（Acipenser schrenckii ♀×A.baeri♂i）消化生理的影响

2022-05-07李芳源王常安刘红柏徐奇友

江西农业大学学报 2022年2期

李芳源，王常安，刘红柏，徐奇友

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨 150070；2.南京农业大学无锡渔业学院，江苏南京 210000；3.湖州师范学院，浙江湖州 313000）

【研究意义】鱼粉作为优质蛋白源是鱼类饲料的重要组成部分。在鱼粉量少价高的情况下，为满足鱼类对蛋白质的需求，寻求鱼粉的可替代物成为饲料研究中的热点[1]。在许多植物蛋白中，大豆蛋白因具有较高的蛋白质和相对均衡的氨基酸已成为水产养殖中主要的鱼粉替代品[2]。然而，大豆蛋白含有的抗营养因子（凝集素、寡糖、皂苷和胰蛋白酶抑制剂）可能会阻碍蛋白质消化、削弱免疫反应并引起肠道炎症，从而阻碍鱼类生长[3-4]。【前人研究进展】目前，大豆蛋白饲料在南方鲇（Silurus meridionalis）[5]、尼罗罗非鱼（nile tilapia）[6]、军曹鱼（Rachycentron canadum）[7]、欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax）[8]、黑鲷（Acanthopagrus schlegelii）[9]，斑马鱼（Danio rerio）[10]、星突江鲽（Platichthys stellatus）[11]，大西洋牙鲆（Paralichthys dentatus）[12]，黄金鲈（Perca flavescens）[13]等多种水产动物中使用，并且发现大豆蛋白部分替代鱼粉能够促进水产动物生长，高比例替代鱼粉会对肠道健康造成影响。【本研究切入点】大豆经热处理后加工生成膨化大豆，不仅保留了大豆本身的营养成分，还降低了大豆中对热敏感的抗营养因子，能够促进水产动物对大豆蛋白的消化吸收。左亚男等[14]研究发现用添加了蛋氨酸的膨化全脂大豆粉替代20%鱼粉蛋白时，乌鳢（Channa argus）的平均增重率显著高于80%和100%替代组。在鲤鱼（Cyprinus carpio）[15]和杂交鲟[16]研究中也有类似结果。因此，有关膨化大豆替代鱼粉促进水产动物生长的研究受到很多人关注。【拟解决的关键问题】鱼的生长与体内消化酶活性及肠道性能相关，本试验旨在研究膨化大豆替代鱼粉后对杂交鲟消化能力及肠道结构影响，以期为杂交鲟饲料配制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

对照组饲料以膨化大豆、豆粕、进口蒸汽鱼粉、大豆浓缩蛋白、进口肉骨粉、喷雾干燥血粉、玉米蛋白为蛋白源。用膨化大豆分别替代100%（G1）、75%（G2）、50%（G3）、25%（G4）和0%（G5）鱼粉，配制成5种等氮等能饲料。试验基础饲料配方及营养水平见表1[16]。配制饲料前，将所有原料粉碎过80 目筛，混匀后加入豆油和鱼油充分混合，再加入适量水混合，用鼓型混合机混合后膨化制成直径为3 mm 的颗粒，置于-20 ℃冰箱中备用。

表1 基础饲料配方及营养水平Tab.1 Formula and nutritional level of the experiment feed

1.2 饲养管理

试验杂交鲟体质量为（75.0±4.3）g由黑龙江省抚远县水产技术推广站提供。试验在哈尔滨市鱼苗种场进行。试验鱼用试验饲料驯化15 d 后，挑选体质健壮、大小均匀的杂交鲟600 尾，随机分成5 个处理，每处理设3 个重复，每个重复120 尾，饲养于室内水族箱（220 L）中，每水槽取30 尾经饥饿24 h 后的鱼测量其体质量和体长作为生长指标初始值。试验用水为循环混合水（电场余热水和深井水混合），水温19.0～23.0 ℃，溶氧大于6 mg/L。每天投喂6次，饱食投喂。试验共进行42 d，结束后，鱼空腹24 h，称量每水槽鱼总质量，取30尾测量体质量和体长作为生长指标结束值。

1.3 样品采集

试验结束后，从每个水槽中随机选取4 尾鱼，在冰盘上分别取胃、肠道（不含内容物）和胰腺，液氮速冻，分装保存于-80 ℃超低温冰箱。样品分析前于4 ℃冰箱内解冻，在冰盘迅速准确称取一定量的组织，按1∶9 重量体积比（w/v）加入预冷生理盐水，用高速组织匀浆机匀浆（15 000 r/min，3 min）稀释，4 ℃下4 500 r/min离心15 min，取上清液测定消化酶活性。

1.4 消化酶活性测定和组织切片观察

消化酶活性测定：蛋白酶以福林-酚法测定，脂肪酶用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法测定，淀粉酶测定以淀粉-碘比色法[17]。

组织切片：每重复随机取4 尾鱼的中肠、瓣肠于Bouin’s 液中固定48 h，常规石蜡包埋后，用KD1508型切片机对样本进行横方向连续切片，切片厚度为6µm，苏木精-伊红染色法染色，中性树胶封片，Motic光学显微镜下观察肠道结构病理变化。

1.5 统计分析

试验结果用SPSS19.0过程进行单因素方差分析和Duncan’s多重比较，显著性水平P值为0.05。

2 结果与分析

2.1 膨化大豆替代鱼粉对杂交鲟蛋白酶活性的影响

从表2可见，饲料中膨化大豆水平对杂交鲟消化系统的蛋白酶活性影响不大（P＞0.05）。随着饲料中膨化大豆水平的增加，中肠、瓣肠、幽门盲囊、胃的蛋白酶活性无显著性差异；且与对照组（G5）相比，中肠、瓣肠、幽门盲囊、胃的蛋白酶活性有所下降。

表2 膨化大豆替代鱼粉对杂交鲟蛋白酶活性的影响Tab.2 Effects of fish meal replacement by full-fatty extruded soybean on protease activities of hybrid sturgeon

2.2 膨化大豆替代鱼粉对杂交鲟脂肪酶活性的影响

从表3可见，饲料中膨化大豆水平对杂交鲟消化系统的蛋白酶活性影响不大（P＞0.05）。随着饲料中膨化大豆水平的增加，中肠、瓣肠、幽门盲囊、胃的脂肪酶活性无显著性差异；与对照组（G5）相比，中肠、瓣肠、幽门盲囊、胃的脂肪酶活性有所下降。

表3 膨化大豆替代鱼粉对杂交鲟脂肪酶活性的影响Tab.3 Effects of fish meal replacement by full-fatty extruded soy bean on lipase activities of hybrid sturgeon n=3SD

2.3 膨化大豆替代鱼粉对杂交鲟淀粉酶活性的影响

试验结果见表4。饲料中膨化大豆水平对杂交鲟消化系统的淀粉酶活性影响不显著（P＞0.05）。随着饲料中膨化大豆水平的增加，中肠、瓣肠、幽门盲囊、胃的淀粉酶活性无显著性差异；与对照组（G5）相比，中肠、瓣肠、幽门盲囊、胃的淀粉酶活性有所上升。

表4 膨化大豆替代鱼粉对杂交鲟淀粉酶活性的影响Tab.4 Effects of fish meal replacement by full-fatty extruded soybean on amylase activities of hybrid sturgeon n=3；SD

2.4 膨化大豆替代鱼粉对杂交鲟肠道结构的影响

观察中肠和瓣肠的组织切片发现，对照组粘膜上皮细胞排列整齐，上皮结构完整性较好，绒毛发达，柱状上皮细胞排列紧密整齐，杯状细胞较多（图1A、图1D、图1G、图1J）；当替代鱼粉水平为75%时，肠道组织结构完整性被破坏，部分纹状缘融合、脱落，细胞空泡化严重（图1H、图1K），杂交鲟肠道绒毛排列不规律，边缘模糊，褶皱相对稀疏且宽度较大，部分褶皱受到破坏（图1B、图1E）；鱼粉替代水平为100%时，肠道组织结构被破坏，微绒毛基本脱落，肠道肠壁增厚，褶皱短而粗、分布稀疏，且多处褶皱受到损伤（图1C、图1F）；杯状细胞减少，柱状上皮细胞排列稀疏，细胞核偏移（图1I、图1L）。

图1 膨化大豆替代鱼粉为杂交鲟肠道结构的影响Fig.1 Effects of fish meal replacement by full-fatty extruded sogbean on the intestinal structure of hyhrid sturgeon

3 讨论

3.1 膨化大豆替代鱼粉对杂交鲟消化酶活性的影响

前期研究表明，部分膨化大豆（25%）替代鱼粉后不影响杂交鲟的增重率及存活率[16]。当豆粕替代比例为75%时对非洲鲶鱼（Clarias Gariepinus）[18]及尼罗罗非鱼[6]的生长性能无显著影响。用30%的大豆浓缩蛋白替代鱼粉降低了黄尾狮幼鱼（Seriola lalandi）的体质量[19]。这表明膨化大豆对不同品种鱼类的生长影响不同。本试验研究发现膨化大豆替代鱼粉对杂交鲟消化系统中的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性影响不显著，与对照组相比，消化系统中的蛋白酶及脂肪酶的活性均有所降低，且胃中蛋白酶及幽门盲囊的脂肪酶活性下降最多；而消化系统中的淀粉酶活性随着膨化大豆替代比例的升高而升高。在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）中同样发现随着酶解豆粕替代鱼粉比例的升高，淀粉酶活性上升[20]。本试验中试验组鱼的消化酶活性与对照组无显著差异，可能与对照组中添加的豆粕有关，对照组的蛋白源由鱼粉跟豆粕共同构成，杂交鲟为肉食性鱼类，肠道对纯鱼粉蛋白源的消化吸收能力强于对照组的混合型蛋白源，鱼粉蛋白更加能增加肠道消化酶的活性，这也可能是各组间消化酶活性不显著的原因。随着日粮中豆粕含量的增加，尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）胃、前肠和后肠中的蛋白酶，脂肪酶和淀粉酶活性显著降低[21]。与鱼粉喂养的鱼相比，豆粕喂养的红鲷（Pagrus major）的肠道中胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，脂肪酶和淀粉酶活性显著降低[22]。在大西洋鲑（Salmo salar）[23]和杂交罗非鱼（Oreochromis niloticus×O.aureus）[24]中也有类似报道。这可能由于随着膨化大豆比例的增加，大豆中的非淀粉多糖增加，非淀粉多糖可降低脂肪酶等的活性[3]。大豆中凝集素的存在会改变肠上皮粘膜分泌情况，导致粘液分泌过多，从而使鱼体内酶的活性下降[4]。唐涛等[25]研究发现膨化豆粕替代48%的鱼粉后显著降低了黄鳝（Monopterus albus）肠道脂肪酶活性。用大豆浓缩蛋白替代鱼粉饲喂黄颡鱼，各组间胃蛋白酶活性无显著差异[26]，与本试验结果一致。这可能是因为大豆浓缩蛋白跟膨化大豆均为大豆的加工产品，大豆经膨化后能够降低抗营养因子的含量，如胰蛋白酶抑制剂、抗原蛋白、大豆异黄酮等，胰蛋白酶抑制因子含量降低有益于胰蛋白酶对营养物质的消化，从而提高杂交鲟的消化能力。

3.2 膨化大豆替代鱼粉对杂交鲟肠道结构的影响

廖珂[27]在研究不同处理豆粕对断奶仔猪肠粘膜屏障影响中发现膨化大豆部分替代精料后，降低了仔猪的腹泻率，改善了小肠的形态结构。用膨化大豆粉的代乳粉饲喂犊牛，其肠道黏膜绒毛变长，绒毛的完整性变好[28]。这表明饲喂少量的膨化大豆能够提高家畜的肠道性能，而膨化大豆对鱼类肠道结构的影响鲜有研究。本试验中当膨化大豆替代比例高于75%时，杂交鲟肠道结构受到破坏，微绒毛排列散乱，肠道褶皱变短，细胞空泡化严重。用豆粕替代30%～60%的鱼粉后，乌鳢（Channa argus）肠道损伤明显，肠壁厚度不均匀，肠道褶皱短而稀疏[29]。大豆蛋白水平的提高也改变了虹鳟（Oncorhynchus mykiss）消化道的组织形态结构，肠粘膜褶皱缩短，固有层粘膜肿胀，肠吸收性细胞核上空泡丧失，上皮固有层和粘膜下层出现白细胞浸润[30]。碳水化合物、抗营养因子（ANFs）的增加以及氨基酸含量的不平衡都会对鱼类的消化系统产生负面影响，从而导致鱼类的生产性能下降[31]。大豆中抗营养因子的含量与其对肠道的损伤成正相关。王彦飞等[32]研究发现随着膨化豆粕替代鱼粉比例的增加，斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）肠道褶皱高度降低，肌层厚度逐渐降低。当大豆浓缩蛋白替代鱼粉水平超过44%时，杂交石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatu♂s）小肠绒毛长度和肌肉厚度显著降低[33]。豆粕过量替代鱼粉会对鲤（Cyprinus carpio）肠道产生损伤同时也会降低肝胰脏蛋白酶的活性[34]。用豆粕替代鱼粉会导致罗非鱼[24]和鲈鱼[13（]Perca flavescens）胃和肠中绒毛的高度降低，排列不规律。这与本试验结果一致。这可能跟大豆中存在的抗营养因子有关，大豆经膨化后并不能使抗营养因子完全剔除，只能降低胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白等的含量，当膨化大豆替代鱼粉比例过高时，抗营养因子对鱼肠道结构的影响也会增大，严重的会导致肠道炎症的发生。因此，在采用大豆蛋白作为饲料蛋白源时应考虑替代比例在75%以下时对杂交鲟的生长及肠道不造成显著影响。