胃食管反流病患者血浆代谢组学研究及临床观察

刘莉，谢胜*，刘礼剑，黄晓燕，陈雅璐 ，莫秋莲

(1.江西中医药大学 临床医学院， 江西 南昌 330004；2.广西中医药大学第一附属医院， 广西 南宁 530023)

0 引言

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)是由胃或十二指肠内容物反流而导致食管、口咽部甚至肺内出现一系列症状和/或并发症的一种疾病[1]。目前西医治疗本病存在易复发、对非酸性胃食管反流疗效差、手术远期疗效不明确等问题，给患者造成了一定的经济负担和精神心理压力，但中医药治疗在这些问题上具有一定的优势。本课题组长期致力于胃食管反流病的研究，认为本病中医病机复杂，存在多脏腑偏颇与枢机失和的特点，并基于调和心肾、肺肾、肝肺等脏腑枢机以促进脾胃枢机升降恢复的病机认识，创立了芪石升降归元饮用于治疗胃食管反流病。代谢组学是一门研究生物体在不同条件下所产生代谢产物变化的组学技术，是基因组学和蛋白质组学的延伸和终端，具有非侵入性、全面性的特点，与中医学“整体观念”不谋而合，适合于中医中药多靶点、多系统的整体研究。本文将通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术分析GERD患者与健康受试者之间的代谢差异，探索疾病潜在的代谢标志物及分子机制，观察芪石升降归元饮对GERD患者临床症状的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、色谱纯甲酸、色谱纯水、色谱纯丙醇均由Fisher公司提供。

1.2 仪器

Triple TOF5600质谱(AB SCIEX公司)；ExionLC AD液相色谱系统(AB SCIEX公司)；BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm)(美国Waters公司)；JXDC-20型氮气吹扫仪(上海净信实业发展有限公司)；Wonbio-96c型高通量组织破碎仪(上海万柏生物科技有限公司)；SBL-10TD型超声波清洗机300W-10L(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Centrifuge 5430R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；NewClassic MF MS105DU型电子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.3 研究对象

选取65例就诊于广西中医药大学第一附属医院的GERD患者，其中有5例患者脱落，随机数字表法分为中药组和西药组，其中中药组：男性患者17例，女性患者13例，总共30例，平均年龄为(53.86±11.37)岁，病程(12.75±4.04)月，BMI(21.74±7.62)kg/m2，每组30例；西药组：男性患者19例，女性患者11例，总共30例，平均年龄为(52.71±12.12)岁，病程(12.74±4.17)月，BMI(21.65±6.94)kg/m2。两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.4 纳入标准

① 符合GERD诊断标准[2]的患者；②年龄在18～70岁；③30 d内未参加其他临床研究者；④经充分沟通，自愿参加本项目并签署知情同意书者。

1.5 排除标准

① 有严重脊柱外伤及皮肤烧伤等疾病者；②有消化道手术病史；③有严重的消化道溃疡、消化道占位、其他严重消化性疾病及并发症者；④妊娠或哺乳期妇女；⑤有严重肝肾功能不全、患恶性肿瘤，经临床医师评估不能耐受胃镜检查者；⑥合并其他免疫性、器官衰竭等疾病者；⑦合并无法控制可能伤及他人的精神病患者；⑧合并有其他严重传染病者，如肺结核、抗 HIV 阳性者；⑨近7 d内服用过可降低食管下端括约肌张力的药物(如普鲁本辛、颠茄、阿托品、氨茶碱、烟酸、异博定、心痛定、安定等)的患者；⑩不愿合作者。

1.6 药物与治疗方法

中药组给予芪石升降归元饮，药物组成包括黄芪 30 g、党参 15 g、熟地 30 g、山药 30 g、麦冬 20 g、茯苓 15 g、生麦芽 20 g、赤石脂 15 g(先煎)、砂仁 10 g(后下)、鸡内金 10 g、知母 10 g、升麻 10 g、桔梗 10 g、巴戟天 10 g、五味子 5 g、柴胡 5 g。每日 1 付，每日 2 次，每次1包，早餐和午餐前，连续服用28 d。芪石升降归元饮由广西中医药大学第一附属医院药房提供。

西药组给予雷贝拉唑肠溶胶囊(成都迪康药业股份有限公司，国药准字H20040715，规格为每粒20 mg)，用法：每次1粒，每日1次，早上空腹口服，连续28 d。

2 观察指标

2.1 临床疗效

参照《胃食管反流病中西医结合诊疗共识意见(2017年)》中的症状疗效评定标准[3]，详细记录患者的症状严重程度以及发作频率，对比两组患者用药前后临床症状积分，积分降低>80%为显效，50%～80%为有效，≤50%为无效。

2.2 胃食管反流病问卷(GERD-Q)、反流性疾病问卷(RDQ)评分

通过GERD-Q问卷、RDQ问卷评估治疗前后患者反流症状。根据GERD-Q症状评分降低程度评估总有效率[总有效率=(显效例数+有效例数)/总例数×100%][4]。GERD-Q症状评分降低≥75%为显效；75%>评分降低≥50%为有效；评分降低<50%为无效。

2.3 LC-MS血浆样本制备及检测

在用药前，采集12例GERD患者及12例健康受试者空腹状态下的静脉血5 mL，4 ℃，2 500 r/min离心，吸取上层血浆，冻存管中存放于-80 ℃冰箱保存待测。从24例样本中各取100 μL血浆，制备成LC-MS样本[5]，通过上海美吉生物医药科技有限公司生信云平台进行数据分析(www.majorbio.com)。

2.4 统计学处理

运用SPSS 22.0软件进行对数据分析，计数资料采用配对样本t检验，计量资料采用秩和检验。P<0.05表示有统计学差异，P<0.01表示有显著统计学差异。通过R软件包ropls(Version1.6.2)对代谢组学数据进行分析，采用偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)进行多元统计分析使组间区分最大化，并得到变量权重值(VIP)，用Student’st检验进行单变量分析得到P值，根据VIP值大于1或P<0.05为条件筛选出差异代谢物，将筛选出的所有差异物通过KEGG数据库(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)进行富集分析，获得差异代谢物参与的通路。

3 结果

3.1 临床疗效

中药组总有效率高于西药组 (P<0.05) ，差异有统计学意义，两组GERD患者临床疗效比较见表1。

表1 两组GERD患者临床疗效比较Tab.1 Comparison of clinical efficacy between two groups of patients with GERD

3.2 GERD-Q、RDQ问卷评分

两组患者治疗后GERD-Q评分均较治疗前降低，且具有统计学差异P<0.05，治疗后两组组间比较中药组显著优于西药组，具有统计学差异(P<0.01)；两组患者治疗后RDQ评分均较治疗前降低，且具有统计学差异(P<0.05)，治疗后两组组间比较中药组显著优于西药组，具有统计学差异(P<0.01)，两组GERD患者GERD-Q、RDQ评分比较见表2。

表2 两组GERD患者GERD-Q、RDQ评分比较Tab.2 Comparison of GERD-Q and RDQ scores in patients with GERD

3.3 安全性评价

治疗过程中，两组患者均未出现严重不良反应，中药组出现腹泻2例，西药组出现头痛1例，腹泻2例，以上症状无需处理均可自行缓解。

3.4 代谢组学结果

3.4.1 样本比较分析结果

PLS-DA结果显示，GERD患者与健康受试者血浆样本相互分离，代谢轮廓有明显区别，通过PLS-DA置换检验可以得出，阳离子模型计算出R2=0.983，Q2=0.729，阴离子模型计算出R2=0.968，Q2=0.837，未出现过拟合，说明模型合理可靠，可进一步分析差异代谢物，PLS-DA结果如图1所示。

3.4.2 差异物代谢物分析

结合PLS-DA多元统计分析获得的VIP值以及单变量分析t检验得出的P值，进一步筛选差异代谢物(VIP值大于1或P<0.05)，得出两组样本之间存在86个差异代谢物，其中有38个代谢物表达上调，48个代谢物表达下调，对得到的差异代谢物绘制火山图如图2所示。

图1 PLS-DA结果Fig.1 PLS-DA results

(a)阳离子模式 (b)阴离子模式

3.4.3 KEGG通路富集分析

对差异代谢物通过KEGG数据库进行筛选，结果表明一共富集到了27条代谢通路，分析发现有23个代谢物被显著富集到影响值大于0.1的通路，包括亚油酸代谢通路、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路、精氨酸生物合成通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路，此外还富集到色氨酸代谢通路以及AMPK通路等。KEGG拓扑气泡图，如图3所示。

A.亚油酸代谢通路；B.D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路；C.精氨酸生物合成通路；D.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路图3 KEGG拓扑气泡图Fig.3 KEGG topology bubble diagram

4 讨论

胃食管反流病典型的临床症状是反酸及胸骨后灼热感，中医本病当属“吐酸”“食管瘅”“嘈杂”等范畴，禀赋不足、脾胃虚弱为本病发病基础，病机责之于“逆、热、郁”，临床上常常表现为虚实夹杂，与脾、肺、肝、肾有关[6]。本课题组认为脾胃虚弱为本病的病机表象，而多脏腑功能偏颇，尤其是肺肾失和是本病的病机关键[7]。“肺者，气之本”，脾胃运化产生的水谷精微之气上输于肺与自然清气聚于胸中，通过肺的肃降功能将宗气及水谷精微布散与其他脏腑，故胃腑之和降功能需有赖于肺气的宣发肃降；“肾者，胃之关也”，肾阳虚衰，脾不升清，浊阴上逆，或肾阴不足，胃失濡润，开合不利，胃气上逆，均可见吐、逆之症，故拟芪石升降归元饮，该方由张锡纯升陷汤及陈士铎引火汤加山药、党参、煅赭石、炒鸡内金、生麦芽、麦冬、砂仁而成，升陷汤益气升阳除阴火，引火汤滋补肝肾降相火，党参、山药、鸡内金补脾益肺，少佐麦芽以遂肝之性，砂仁通畅三焦、暖肺醒脾，妙用代赭石以镇诸逆，使气血津液归于本元(源)。课题组团队前期临床研究证明，芪石升降归元饮能明显改善患者反酸及因反流所致的睡眠障碍，红外皮温显示患者用药后头面部及胸部皮温降低，腰腹部皮温升高，全身皮温分布趋于均衡[8]，证明芪石升降归元饮能填补肾精，调节经络枢机，使上焦浮火下潜，从而改善胃食管反流症状。

胃食管反流病的发生与肥胖、吸烟、遗传易感性等因素相关[9]，通过LC-MS技术对GERD患者血浆及健康志愿者进行血浆代谢组学研究，发现两组样本代谢物有明显差异，多元统计分析结果显示本次研究模型合理，并且筛选出86个差异代谢物，共参与了27条代谢通路，其中亚油酸代谢通路最具有统计学意义，其次为D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路、精氨酸生物合成通路，通过KEGG富集分析还发现色氨酸代谢通路、AMPK通路差异具有统计学意义。

本次研究结果表明亚油酸代谢在两组患者代谢途径之间差异最显著，亚油酸是生长和发育所必需的不饱和脂肪酸，亚油酸可转化为花生四烯酸，花生四烯酸是C反应蛋白(CRP)、白细胞白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)炎症因子的前体，可以促进炎症因子的产生[10]。亚油酸能降低类风湿关节炎大鼠血清IL-6、TNF-α的水平，从而减轻大鼠炎症损伤[11]，本次研究得出GERD患者血浆中亚油酸的含量降低，可能与机体炎症反应增加能量消耗有关[10]。D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路中的代谢物L-谷氨酸，是谷氨酸的左旋体，L-谷氨酸对维持消化道粘膜屏障完整性发挥重要作用，其作用机制可能是通过上调小肠黏膜中MUC2黏蛋白的表达，提高黏液层的防御能力[12]。谷氨酸还可通过其受体，刺激一氧化氮(NO)合成，而NO又进一步刺激五羟色胺(5-HT)的释放，有研究证实5-HT参与调控食管对酸的敏感性[13]。

本次研究还发现，两组样本之间在色氨酸代谢方面也存在显著差异，差异代谢物分析得出升高最明显的代谢物为3-吲哚乙腈(3-Indoleacetonitrile)，是由色氨酸代谢所产生的。色氨酸代谢所产生的吲哚衍生物，具有抑制炎症及维护肠道黏膜完整性的作用[14]。AMPK通路与能量代谢有关，从本次研究得出与该通路有关的代谢物为二磷酸腺苷(ADP)，有研究显示脾虚证大鼠心肌细胞ATP、ADP、AMP含量降低，线粒体损伤明显，经针刺双侧足三里穴位后，AMP/ATP值较前增加，LC3-II/LC3-I表达上调，线粒体损伤数量减少，电镜下可观察到较多的线粒体自噬体，说明脾虚证大鼠存在能量代谢合成障碍，推测针刺治疗脾虚证小鼠是通过激活AMPK，促进线粒体自噬，调节能量代谢，从而起到治疗作用的[15]。本课题组前期研究已经证实了胃食管反流病大鼠模型食管ICC细胞内自噬现象的发生，通过背俞指针治疗后，ICC超微结构得到改善[16]，ULK1是与自噬密切相关的一种丝氨酸/苏氨酸激酶，AMPK可以通过激活ULK1活性，调控自噬的发生[17]。

本研究初步探讨了GERD患者潜在的代谢标志物及代谢调控机制，通过临床观察得知芪石升降归元饮用于GERD的治疗取得良好的疗效，拓展了GERD的诊断和治疗思路。而芪石升降归元饮是否通过调节机体代谢，从而发挥治疗GERD的作用仍需后续进一步验证。