仙麻平喘汤对哮喘小鼠干预作用的实验研究

蒋鹏娜，张佩青，王丽洁

(1黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036；2黑龙江中医药大学附属第一医院·黑龙江 哈尔滨 150040)

仙麻平喘汤是本院临床用于治疗哮喘的有效验方，全方以“阳虚痰盛”立方，以温阳益气为主，兼以平喘化痰，综观全方温阳利湿，阳气足湿气化，益气纳肾，一身之气足则喘平气顺，补中有消，温中有行，肺脾肾三脏同调，临床使用多年疗效可靠。本实验是在前期实验基础上进行的关于仙麻平喘汤对哮喘模型小鼠肺组织损伤以及对气道阻力的干预效果观察，以期为该药治疗哮喘的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级健康雌性BALB/c小鼠50只， 8～12周龄，体质量18～22 g，黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，动物生产许可证号SCXK(黑)2019-03，于黑龙江省中医药科学院动物中心饲养，实验动物使用许可证号SYXK(黑)2016-008，5只1笼，提前1 周进行环境适应，实验室温度18～25 ℃，相对湿度40%～75%。

1.2 实验药物 仙麻平喘汤：淫羊藿、黄芪、麻黄、五味子、紫菀、细辛、射干、款冬花、半夏、生姜、大枣，上述中药饮片均购于黑龙江省中医药科学院草药局。仙麻平喘汤合煎液制备：分别称取相应剂量上述药材，浸泡30 min，1煎8倍水，1.5 h，滤出药液；2煎4倍水，1.5 h，滤出药液；合并两次药液，转移至旋蒸仪中浓缩，定容至浓度1.26 g生药/mL，给药剂量为25.2 g/(kg·d)，得到仙麻平喘汤合煎液。仙麻平喘汤混合液制备：分别称取相应剂量上述药材分别浸泡30 min，分别以合煎组的时间、加水倍数条件煎煮，最后合并药液；分别转移至旋蒸仪中浓缩，各自定容至200 mL，最后混合药液定容至1.26 g生药/mL，剂量为25.2g/(kg·d)，得到仙麻平喘汤混合液。上述药液别冷藏至-20 ℃冰箱保存，用时于-4 ℃冰箱保存。地塞米松磷酸钠注射液(1 mL∶5 mg)：国药准字H42020019，天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司，生产批号：52003281。

1.3 主要试剂及仪器 OVA卵蛋白：上海伯奥生物科技有限公司；乙酰胆碱：合肥博美生物科技有限责任公司。403H超声雾化机：江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；EMKA-WBP清醒小动物给药和呼吸生理检仪：法国EMKA Technologies；光镜:OLYMPUS。

2 实验方法

2.1 动物分组、模型制备及给药 小鼠适应性饲养1 周，50只小鼠按照随机数字表法分成5组，分别为正常对照组、模型组、地塞米松组、仙麻平喘汤合煎液组、仙麻平喘汤混合液组，每组10只。用OVA致敏以及激发进行造模[1]，周期为28 d，第1天与第8天在小鼠皮下和腹腔注射0.1 mL/只(每0.2 mL含OVA 0.1 mg,AL(OH)30.02 mg)进行OVA致敏，致敏后第15～28天，用5%OVA进行雾化，20 min/次，每天1次；正常组予生理盐水注射或雾化。于致敏后第19天，地塞米松组予地塞米松磷酸钠注射液(0.3 mg/kg)灌胃，仙麻平喘汤合煎液组予合煎液(25.2 g/kg)灌胃，仙麻平喘汤混合液组予混合液(25.2 g/kg)灌胃，正常组用等体积生理盐水灌胃；每天1次，连续灌胃10 d。于第29天行检测。

2.2 观察指标及检测方法

2.2.1 肺功能检测 将实验小鼠放入调整好的清醒小动物给药和呼吸生理检测仪激发室中，采用乙酰胆碱液进行激发，每次激发1 min，连续激发并进行记录，激发浓度分别为6.25、12.50、25.00、50.00 g/L；记录小鼠气道阻力(RI)。

2.2.2 外周血嗜酸细胞(EOS)计数 肺功能测定完毕后，麻醉小鼠，目眶采血20 μL，加入EOS计数液0.38 mL，充分混合摇匀，调整显微镜目镜倍数10×10，随机选取10个大方格，并计录EOS数量(X)。EOS数量=X×20×109个/L。

2.2.3 肺组织病理学观察 腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉处死小鼠，取右肺上叶用10%福尔马林固定，严格按照HE染色步骤进行操作，先进行脱水，再石蜡包埋，然后切片、染色，并在光学显微镜下进行病理观察。

3 结果

3.1 各组小鼠肺功能检测结果 见表1。

表1 各组小鼠气道阻力(RI)测定结果比较

实验结果表明：仙麻平喘汤合煎液、仙麻平喘汤混合液、地塞米松可以抑制不同浓度乙酰胆碱液(Ach)激发状态下小鼠气道的penh值，具有一定的缓解和干预作用，统计分析说明地塞米松组的抑制作用较明显，而仙麻平喘汤合煎组以及仙麻平喘汤混合组与地塞米松组比较，无统计学意义(P>0.05)。

3.2 各组小鼠外周血EOS计数比较 见表2。

表2 各组小鼠外周血EOS计数比较

实验结果表明，小鼠经卵蛋白致敏和刺激后，小鼠体内的应激提高，出现过敏反应，而且血液中EOS的计数也明显增多，地塞米松、仙麻平喘汤合煎液、仙麻平喘汤混合液均对小鼠的EOS表达有明显的抑制作用，三者比较无统计学意义(P>0.05)。

3.3 各组小鼠肺组织病理变化 正常组：正常肺小叶结构，肺泡上皮细胞无变性﹑无坏死、无脱落，肺间隔、肺泡腔及支气管腔、支气管壁完整，细胞排列规整。模型组：肺小叶结构破坏，肺泡上皮细胞坏死脱落，1/3肺组织出现炎性细胞浸润和肺泡壁充血，支气管平滑肌厚度明显增加，证明小鼠出现哮喘的病理表现。地塞米松组：肺小叶结构破坏较轻，支气管平滑肌厚度轻度增加，局部肺泡上皮细胞有坏死脱落，肺泡间质内具有轻度的炎性细胞浸润。仙麻平喘汤合煎液组：肺小叶结构破坏较轻，支气管平滑肌厚度略有增加，局部肺泡上皮细胞有坏死脱落，肺泡间质内具有轻度的炎性细胞浸润。仙麻平喘汤混合液组：肺小叶结构破坏较轻，支气管平滑肌厚度轻度增加，局部肺泡上皮细胞有坏死脱落，肺泡间质内具有轻度的炎性细胞浸润。

图1 各组小鼠肺组织病理观察结果(HE，×200)

4 讨论

支气管哮喘是常见呼吸系统疾病之一，黄帝内经《素问·阴阳别论篇第七》中既有其相关症状的详细论述“阴争于内，阳扰于外，魄汗未藏，四逆而起，起则熏肺，使人喘鸣”。在引起哮喘发病的众多病因中，风寒袭肺当居于首位，《证治心得》中的“风寒之邪受自皮毛故得以入肺而为喘……”的记载；赵西斌等[2]总结儿童哮喘常由风寒等外因以及肺脾肾三脏阳气不足，两寒相合，故气逆而上导致哮喘。仙麻平喘汤以温阳益气为主，兼以平喘化痰，全方由临床常用的经典古方射干麻黄汤加淫羊藿、黄芪等而成。《金匮要略》有言：“咳而上气，喉中水鸡声，射干麻黄汤主之”，在辛凤[3]报道的研究中发现，射干麻黄汤可减少哮喘患者EOS的增加，并能促进EOS的凋亡，能调控TRPV2 mRNA的表达，从而抑制神经生长因子(NGF)、前列腺素(PGs)的过度释放，减轻TRPV2诱发与促进气道高反应性和慢性炎症的刺激，多环节治疗哮喘。另外研究还发现射干麻黄汤治疗哮喘性肺炎大鼠肺组织中的炎症因子IL-4、IL-13及TNF-α的表达与射干麻黄汤的剂量成负相关[4]。

仙麻平喘汤是在射干麻黄汤方中加入黄芪和淫羊藿，本方既可以增强机体免疫功能，还能对抗氧自由基，增强机体抗缺血、缺氧能力，另外黄芪在促进淋巴细胞转化率，减轻支气管黏膜炎性水肿，改善临床症状，减少环磷酸苷分解，松弛支气管平滑肌，促进排痰，扩张血管，降低血流阻力等方面均有良好的疗效[5]。另有研究证实，黄芪和淫羊藿联合，不但能减轻哮喘气道炎症，提高疗效，减轻患者对激素的依赖性,减少激素用量,而且还可改善下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能,促进内源性糖皮质激素的释放[6]。

本实验中用卵蛋白致敏小鼠后，又经卵蛋白雾化刺激，导致小鼠的肺组织中炎症细胞浸润和肺泡壁充血，支气管平滑肌厚度增加，说明造模的方法是可行的，而且血液检查EOS也证明，小鼠血液中EOS的计数明显增多，应激增高，出现过敏反应，实验还通过清醒小动物给药和呼吸生理检测仪对小鼠的气道阻力进行测定，同样也证明小鼠的气道有痉挛的存在。

从本次实验发现，虽然小鼠气道的反应性和乙酰胆碱(Ach)的浓度成正相关，随着Ach浓度的增加，小鼠气道反应性数据penh也增加，但仙麻平喘汤合煎液、仙麻平喘汤混合液以及地塞米松均有干预小鼠气道高反应的作用，最后结果表明，仙麻平喘汤合煎液与混合液的疗效均可起干预效果，说明仙麻平喘汤有良好的宣肺平喘作用。