细菌内毒素检测法与家兔法同步检测4种中药注射液热原的研究*

何露 阳姣 吴梅 熊涛 张翅

[华润三九（雅安）药业有限公司，四川 雅安 625000]

中药注射剂安全性问题的日益突出[1]，要求不断提高中药注射剂的质量水平，加强中药注射剂生产过程中安全性研究已成为焦点。生产过程中的安全性主要体现在热原方面。热原是微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质[2]。极微量（1～5 ng/kg）的内毒素进入人体即可引起发热反应[3]。药品中的热原主要是细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌甚至病毒也能产生热原[4]。热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物。磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最强，其化学组成因菌种不同而有所差异，分子量为5×104～5×105，分子量越大致热作用越强。热原具有耐热性、滤过性、水溶性、不挥发性、吸附性，能被强酸、强碱、强氧化剂及超声波破坏等特点[5]。

中药注射液热原主要是生产过程中微生物污染引起[6]。在中药注射液生产过程中，加强提取过程和制剂过程等生产过程的监测对保证产品质量控制非常重要。本研究针对有代表性的参附注射液、参麦注射液、生脉注射液、红花注射液4种中药注射剂生产过程中热原安全性问题进行研究，进行家兔热原检查法和细菌内毒素检查法的比较研究，为4种中药注射液乃至中药注射液的热原安全性检查方式提供一定研究思路和新的检测模式。

1 材料与方法

1.1 仪器

DHG-9246A电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；LKL164-03动态试管检测仪（英国莱伯金耐特）；XW-80A旋涡混悬仪（上海驰唐电子有限公司）；WRY-2015微机热原测温仪（上海辽卓科贸有限公司）；DJ-06WH电子天平（成都倍赛克仪器所）；移液枪（100～1 000 μL，梅特勒）。

1.2 实验试剂

细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，80 EU/支150601-201886）；动态浊度法用鲎试剂（广东湛江安度斯有限公司，0.01～10 EU/支1806210）；细菌内毒素检查用水（广东湛江安度斯有限公司，30 mL/瓶，1810180）。

1.3 实验样品

生脉注射液（XT-180901XT-180902-1XT-180903，180904010180905010180901020）；参附注射液（XT-180806XT-180807XT-180901，180905010180906010180907010）；参麦注射液（XT-180903-1XT-180901-1XT-180902-1，181001010180903020180905020）；红花注射液（XT-180901/01-02XT-180905/05-06XT-180913/13-14，181001010181002010181002010）。提取液：4个品种提取液各3批次按照注射剂比例配制后，用细菌内毒素检查用水配制成全量，采用50 mL已除热原的玻瓶和胶塞进行包装，按照产品对应的灭菌参数灭菌后待用。成品制剂：4个提取液对应生产的4个成品制剂各3批次。

1.4 实验动物

实验家兔，日本大耳白，普通级，雌雄兼有，体质量1.7～4.0 kg，160只，购于四川省实验动物专委会养殖场，动物生产许可证号：SCXK（川）2018-14，饲养于华润三九（雅安）药业有限公司检测中心大兴实验动物楼家兔饲养区，非屏障系统。饲养温度17～25℃，湿度40%～70%，12/12 h明暗交替照明，单笼饲养，无垫料，每天自动冲洗粪便。饲料为兔全价颗粒饲料，由四川省实验动物专委会养殖场提供。饮水为清洁自来水。

1.5 细菌内毒素限制（L）的确定

L=K/M，K为人每千克体质量每小时最大可接受的细菌内毒素剂量，注射剂K=5 EU/（kg·h）。红花注射液限值L为7.5 EU/mL，结合临床用药、实际生产、检验及样品实际情况，为更好地控制生产过程中的细菌内毒素，将红花注射剂的细菌内毒素限值标准提高为0.5 EU/mL，高于计算结果的要求，故最大稀释倍数计算时，L取值0.5 EU/mL。

1.6 光度法鲎试剂标准曲线可靠性试验

1.6.1 鲎试剂准备 取鲎试剂（0.1～10 EU/支）1支，在安瓶颈划痕，用浸泡过异丙醇的无纺布擦拭后从颈部处折断（避免玻璃屑落入瓶内引起干扰）。用无热原的刻度吸管或移液器准确吸取细菌内毒素检查用水1.25 mL沿瓶壁加入安瓿内，轻轻摇匀，使内容物全部溶解（避免产生气泡）。取反应试管11支，分别按1.5、0.15、0.015 EU/mL各浓度平行3管，阴性平行2管。

1.6.2 内毒素标准溶液准备 取细菌内毒素工作标准品1支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，在安瓿顶端划痕，用浸泡过异丙醇的无纺布擦拭后从划痕处折断（避免玻璃屑落入瓶内引起干扰）。加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合，然后进行稀释，分别得到1.5、0.15、0.015 EU/mL浓度的细菌内毒素标准溶液，每稀释一步均在旋涡混合器上混合30 s。

1.7 供试品干扰实验

药典或国家标准中或有其他内毒素检验标准中已有规定的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定限值和不干扰浓度后再进行内毒素检查。

1.7.1 供试品的最大有效稀释倍数 最大稀释倍数计算：MVD=CL/λ=（0.5 EU/mL）/（0.03 EU/mL）=16.6倍。按用法用量和限值计算公式计算出来，限值L为7.5 EU/mL，结合临床用药、实际生产、检验及样品实际情况，为更好地控制生产过程中的细菌内毒素，将红花注射剂的细菌内毒素限值标准提高为0.5 EU/mL，高于计算结果的要求，故最大稀释倍数计算时，L取的值为0.5 EU/mL。

1.7.2 内毒素标准溶液的制备（C溶液） 按照“1.6.2”进行内毒素标准溶液的制备，得到浓度分别为1.5、0.3、0.15、0.015 EU/mL的内毒素标准溶液。

1.7.3 供试品溶液配制（A溶液）

1.7.4 供试品阳性对照溶液配制（B溶液）

1.7.5 加样及反应 取2支鲎试剂，用细菌内毒素检查用水将其复溶，复溶后将软件进入待采集状态。将3支复溶好的鲎试剂溶液合并在一起，轻轻混匀避免产生气泡。将鲎试剂分装于32支反应试管中，0.1 mL/管；将相应的溶液A、B、C、D加至反应管中，0.1 mL/管，每个浓度平行2管，将反应混合液混匀（在漩涡混悬仪上轻点一下即可）。混匀后将反应管插入动态试管仪开始反应，然后填写试验参数，如试剂批号、各反应孔的反应项目及参数等。与鲎试剂反应将A、B、C溶液与鲎试剂各25 μL，加入BET检查反应微孔板，每个浓度均平行测2孔，BET水作为阴性对照（即D溶液），平行测2孔。依照用动态试管测试仪测定。按照标准曲线所得回归方程计算各供试品溶液和含标准内毒素溶液的内毒素含量Ct和CS，按下式计算该试验条件下的回收率（R）：R=（CS-Ct）/λm×100%，无干扰浓度回收率在50%～200%。

1.8 家兔热原检查

按《中国药典》现行版四部通则热原检查法进行操作，选符合规定的家兔，试验前1 h停止给饲料和水，称重后置于家兔固定盒内。每隔30 min测量家兔体温1次，测2次，2次体温之差不得超过0.2℃，以此2次体温的平均值作为该兔的正常体温。每批供试品选用3只家兔。在测定正常体温后15 min内给药，给药后每隔30 min测量体温1次，共6次。

2 结 果

2.1 标准曲线可靠性试验

标准曲线方程为LgTg=2.8916-0.2753LgC，相关系数（r）绝对值为0.997，阴性对照的反应时间＞3 600 s，反应重复管的变异系数（CV）均≤10%（表1），标准曲线试验成立，表明试验方法有效。

表1 动态浊度法标准曲线可靠性试验结果

2.2 供试品干扰试验

采用细菌内毒素动态浊度法对4个注射剂品种从提取液到成品制剂的细菌内毒素含量测定，并同步进行热原检查。通过两个结果之间的比较证明中药注射剂采用细菌内毒素定量测定法与热原检查结果是否存在一定的相关性。

4个注射剂品种提取液和对应的成品制剂细菌内毒素含量按照现行版《中国药典》1 143细菌内毒素检查法中的动态浊度法进行测定。见表2。

表2 4种注射剂品种细菌内毒素干扰试验结果

2.3 检查结果

提取液、成品制剂的热原检查按照现行版《中国药典》1 142热原检查法进行测定，结果见表3。通过对12批提取液和对应的12批成品制剂进行细菌内毒素含量测定，可以看出提取液细菌内毒素含量低，则对应的成品制剂内毒素含量也低。用家兔法进行热原检查对应的24批次产品均合格，进一步说明细菌内毒素和热原结果均较稳定，有一定的相关性。试验中比较了4种注射液（参麦注射液、生脉注射液、参附注射液、红花注射液）生产过程中的家兔热原法和细菌内毒素检查法（动态浊度法），为该品种质量标准的提高提供了一定的研究思路和理论依据，基于上述的比较研究，提示细菌内毒素检查法可作为4种注射液过程控制中热原检查的补充方法，更好地控制质量。

表3 4种注射剂品种细菌内毒素含量测定方法统计表

3 讨 论

中药注射剂是我国特有的剂型，依据中医辨证施治理论，依据现代工艺制备得到，近些年来的重大公共卫生事件中，中药注射剂在其中扮演了不可或缺的角色。参附注射液、参麦注射液、生脉注射液等一系列中药注射剂先后被列入2003年《传染性非典型肺炎（SARS）中医诊疗指南）》[7]、2010年《手足口病诊疗指南》[8]、2013年《人感染H7N9禽流感诊疗方案》[9]、2014年《登革热诊疗指南》[10]、2015年《中东呼吸综合征病例诊疗方案》[11]、2021年《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》[12]，在历次防治重大急性传染病中发挥了重要作用。中药注射剂成分复杂，生产工艺周期普遍较长，在生产过程中存在着较多的未知因子，尤其需要在内毒素方面进行监控。参附注射液、参麦注射液、生脉注射液、红花注射液4种中药注射剂，为临床常用药，对于这类疗效确切的中药注射品种尤其需要加强热原的检测，不仅有利于临床安全使用，而且对于生产各环节的热原控制也具有显著意义[13-14]。

细菌内毒素检测法的机制在于微量的内毒素与鲎试剂中的C因子发生反应[15]，激活凝固酶，切断凝固蛋白特定位置的精胺酸肽键，形成凝固蛋白，产生凝胶过程的浊度变化，根据测定到达事先设定反应液的浊度变化值所需要的时间对数与细菌内毒素浓度对数的反比关系定量供试品内毒素水平。细菌内毒素检测法具有检测范围宽、准确、灵敏、可重复及快速等优点。细菌内毒素检测法是FDA认可的检查法，该法已成为细菌内毒素定量法的主流，细菌内毒素检测法检测阳性的注射液患者死亡率可达66.7%[16]。

表4 4种注射剂提取液和成品制剂细菌内毒素及热原检查结果

本试验通过对12批中药提取液和对应的12批成品制剂通过动态浊度法进行细菌内毒素含量测定，检测出的细菌内毒素含量与对应的成品制剂的含量存在一定的相关性。同时用家兔法对12批提取液和对应的12批成品制剂进行热原检查，其结果均合格，进一步说明以上4个中药注射剂品种建立细菌内毒素检查法可以作为热原检查的补充试验方法。