昆明小鼠耳蜗内脂肪酸转运蛋白4的表达与分布

胡一勇，鄢斌成，于宁，吕萍

(1.自贡市第一人民医院 耳鼻咽喉头颈外科，四川 自贡 643000；2.中国人民解放军总医院 耳鼻咽喉头颈外科 解放军耳鼻咽喉研究所 国家耳鼻咽喉疾病临床医学研究中心 聋病教育部重点实验室 聋病防治北京市重点实验室，北京 100853；3.川北医学院附属医院 耳鼻咽喉头颈外科，四川 南充 637000)

脂肪酸转运蛋白家族(fatty acid transport protein 4，FATPs)是促进长链和极长链脂肪酸进入细胞的完整跨膜蛋白，在脂肪酸摄取、转运过程中起到重要作用。FATPs在人体各个器官和组织都有分布，已知的FATPs有6种亚型，在各组织的分布与功能研究较为透彻，但是目前在耳蜗的研究报道较少。FATP4作为亚型之一，对长链脂肪酸具有高度亲和力而参与脂肪酸的摄取与转运；脂肪酸β-氧化是心肌的慢性舒缩运动的主要能量来源，而耳蜗主动放大机制需要大量的能量支持。所以FATP4是否也在耳蜗内表达发挥调节耳蜗脂肪酸代谢的作用，以前的研究还未涉及。本实验通过免疫荧光染色检测FATP4在耳蜗各组织的表达分布情况，并应用Western blot法检测耳蜗组织FATP4的表达水平，以此来探索FATP4在耳蜗的表达与分布情况，为进一步研究耳蜗内脂肪酸代谢提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取健康成年(10周)昆明小鼠8只，体重40～50 g，雌雄不限(四川省川北医学院动物中心提供)。参照以往研究，应用ABR测听技术筛选听力正常的昆明小鼠。2只(4耳)用于免疫荧光染色，6只(12耳)用于Western blot蛋白检测。

1.2 主要试剂和设备

兔抗鼠FATP4单克隆抗体(abcam 公司，ab221783),羊抗兔荧光二抗Alexa fluor 647(博奥森公司，bs-0295)，羊抗兔IgG(博士德公司，BA1054)，内参β-actin(bioss公司，bs-0061R)，山羊血清(absin公司，abs933a)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(博士德公司，AR0146)，DAPI染色液(博士德公司，AR1177)，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(博士德公司，AR1112)，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(博士德公司，AR0138)，ECL化学发光液(碧云天公司，P0018A)。脑干诱发电位分析仪(美国Otometrics，chartr EP)，共聚焦显微镜(上海，OLYMPUS FV3000)，SDS-PAGE电泳仪，酶标仪等。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠听性脑干反应(ABR)检测 使用水合氯醛(0.5 g/kg)腹腔注射对动物进行麻醉。待动物完全麻醉后，检查小鼠双侧外耳道，确保外耳道无阻塞，并将其简单固定，覆盖布料保暖。用脑干诱发电位分析仪在隔音环境中测听：将记录电极刺入小鼠颅顶(双耳连线中点处)皮下，参考电极刺入测试耳下方皮下，地极刺入对侧耳下方皮下。将测试耳机放置在外耳道口，确保无阻碍。参数：选择“Click”，滤波宽度500～3 000 Hz，刺激频率12.1次/s，增益100 K，扫描时间10 ms。声音强度设定为80～25 dB SPL，按10 dB SPL递减，当声音强度衰减到接近听阈时，递减间隔为5 dB SPL，以能分辨出可重复的ABRⅠ波的最低刺激声音强度为阈值。同样方法检测对侧耳。

1.3.2 耳蜗标本制备 两组小鼠用水合氯醛(0.5 g/kg)腹腔注射进行麻醉，断头，迅速取下双侧颞骨，分离取出耳蜗。将耳蜗置于预冷的PBS中，并置于冰上，体视显微镜视野下，在蜗尖处打一小孔，迅速从小孔向周围小心剥离蜗壳，尽量去除骨质；然后将其置入EP管中，液氮迅速冷冻后置于-80 ℃冰箱中保存待用。将耳蜗置于4%多聚甲醛溶液中，体视显微镜视野下，在蜗尖处打一小孔，戳破圆窗膜、前庭窗膜，在窝尖小孔处缓慢灌入4%多聚甲醛溶液；将灌流好的耳蜗置于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃过夜，再经10%EDTA溶液脱钙1周，可见耳蜗透明、柔软。将脱钙的耳蜗石蜡包埋后切片，60 ℃温度下烤片后，放入4 ℃冰箱保存待用。

1.3.3 免疫荧光染色 耳蜗石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，0.01 M PBS溶液冲洗10 min，用0.01 M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)煮沸法(95～100 ℃)修复抗原，0.25% tritonx-100处理，滴加10%免疫羊血清封闭非特异性抗原30 min，甩去血清，滴加一抗稀释液(FATP4，1∶400)4 ℃过夜(阴性对照用PBS代替一抗)。次日，取出切片，37 ℃复温20 min，0.01 M PBS溶液漂洗15 min，滴加二抗稀释液(Alexa fluor 647,1∶800),37 ℃孵育40 min，PBS漂洗后，用DAPI复染细胞核10 min，最后抗荧光淬灭封片剂封片。用共聚焦显微镜观察实验结果。

1.3.4 Western blot 检测 提取耳蜗组织总蛋白，按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作步骤检测总蛋白浓度，测定标准曲线为Y=0.000 7，X=0.022 7(

R

=0.996 7)，根据吸光度和标准曲线计算出样本的蛋白浓度，按测得的蛋白浓度计算并配制上样缓冲液。按SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明书配制10%分离胶和5%浓缩胶，电泳：72 V恒压直至看到Marker有红色条带出现，转120 V恒压约60 min，终止电泳。转膜：100 V恒压1 h。根据Marker条带指示裁剪PVDF膜，获取目的蛋白和内参蛋白；用5%脱脂牛奶/TBST封闭PVDF膜1 h后，分别加入一抗稀释液(FATP4，1∶1 000；β-actin，1∶3 000)4 ℃过夜；次日充分漂洗PVDF膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液(羊抗兔，1∶4 000)室温孵育1 h。PVDF膜充分漂洗后，用特敏型ECL化学发光液显色，凝胶成像系统显影。最后结果均以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达量。

1.4 统计学分析

实验数据采用SPSS 20.0统计软件进行分析。所有实验数据以表示，Western blot条带采用Image J软件测量其灰度值。

2 结果

2.1 ABR检测结果

以昆明小鼠ABR曲线的Ⅰ波为判断标准，小鼠ABR反应阈平均为(26.25±2.34)dB SPL，Ⅰ波潜伏期平均为(1.19±0.17)ms。

2.2 FATP4的免疫荧光染色结果

在共聚焦显微镜下，DAPI标记细胞核呈蓝色，FATP阳性呈红色，分别与阴性对照组在同等激光强度下比较，显示FATP4主要表达于昆明小鼠耳蜗的耳蜗螺旋神经节(spiral ganglion，SG)、蜗轴(modiolus，MO)、支持细胞(supporting cells，SC)、内毛细胞(inner hair cells，IHC)、外毛细胞(outer hair cells，OHC)、血管纹的中间细胞(intermediate cell，IC)。见图1。

图1 FATP4的免疫荧光染色结果 A、B：耳蜗蜗轴及螺旋神经节 (×200)，A为阴性对照，B为FATP4在耳蜗螺旋神经节、蜗轴表达；C、D：耳蜗corti器 (×400),C为阴性对照，D为FATP4表达于耳蜗支持细胞(椭圆形处)、内毛细胞、外毛细胞；E、F：耳蜗血管纹 (×400),E为阴性对照，F为FATP4在血管纹中间细胞表达(箭头) 注：耳蜗螺旋神经节：SG;蜗轴：MO;支持细胞：SC;内毛细胞：IHC;外毛细胞：OHC;血管纹的中间细胞：IC。

2.3 FATP4的Western blot结果

图2表明在昆明小鼠耳蜗内有FATP4表达。内参β-actin的分子大小为43 kDa，小鼠的FATP4分子大小在72 kDa左右。FATP4在昆明小鼠耳蜗内的相对表达量(FATP4/β-actin)为 0.695±0.165(

n

=3)。

图2 FATP4的Western blot结果

3 讨论

脂肪酸在机体中发挥着重要的生理功能，过多、过少都会使机体产生一系列的疾病：肥胖、心脑血管疾病、生长发育障碍等；近年来也有报道显示：长期补充ω-3脂肪酸或长期食用富含ω-3脂肪酸的鱼类可以延缓年龄相关性听力损失的发生和发展。而具有转运脂肪酸功能的FATPs是调节脂肪酸代谢的一个重要因子。FATPs有6种亚型，分别是FATP 1-6，其中FATP4对长链脂肪酸具有高度亲和力而参与脂肪酸的摄取与转运。Hensen细胞是耳蜗中唯一含有脂滴的支持细胞，分布于耳蜗corti器外侧，而脂滴的核心组成是长链脂肪酸以及三酰甘油等脂类物质，所以FATP4可能是主要参与耳蜗脂肪酸代谢的脂肪酸转运蛋白。Suzuki等通过免疫组织化学发现小鼠耳蜗支持细胞、螺旋神经节和血管纹有脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding proteins，FABP)表达。FABP与FATP都是参与脂肪酸代谢的重要蛋白，本实验结果显示昆明小鼠支持细胞、外毛细胞、内毛细胞、血管纹的中间细胞、蜗轴、螺旋神经节都有FATP4表达，与Saino-Saito、Suzuki等证明的FABP在小鼠耳蜗内表达和分布结果较为一致。

外毛细胞具有双向放大作用，一方面是将机械的声波转换为膜电位，另一方面膜电位形成的同时使外毛细胞收缩伸展，产生主动放大作用，这个过程极可能需要消耗大量的能量。所以，早在二十世纪五十年代就有人提出在听觉器官受刺激的过程中，为了获得营养和氧气，毛细胞必须有一个高度专业化的营养辅助系统。耳蜗基底膜外侧的支持细胞—Hensen细胞拥有大量脂滴，是主要营养细胞之一。但是Hensen细胞自身没有与脂肪酸代谢相应的线粒体和内质网系统，而与之相邻的外毛细胞含有发达的线粒体及内质网系统。所以为适应外毛细胞的生理功能，Hensen细胞内脂类物质可能通过FABP介导转移到细胞膜周围，再通过FATP转运到外毛细胞，最后通过β-氧化，为外毛细胞提供能量，维持外毛细胞“耳蜗放大器”的功能。血管纹、螺旋神经节细胞也有FATP4、FABP表达，因此血管纹和螺旋神经节可能利用脂肪酸代谢调节自身的功能，这更好的有利于血管纹对内淋巴离子浓度、能量转换、无机盐、水的调控和转运以及螺旋神经节细胞对听觉冲动的产生和传递。既往对耳聋发生机制的研究多集中于毛细胞的机械性损伤、代谢性损伤、药物性损伤、钙超载学说等。但是耳蜗细胞通过能量代谢调节耳蜗功能的研究还未涉及。本实验通过免疫荧光染色、Western blot检测发现了耳蜗中脂肪酸代谢的证据，为进一步研究耳蜗内脂肪酸代谢提供了理论依据。