COX-2 和 PTEN 在中耳胆脂瘤中的表达及相关性研究

陈曦，费静，刘兰，李雷激

(1.西南医科大学附属医院 耳鼻咽喉头颈外科，四川 泸州 646000；2.重庆医科大学附属大学城医院 耳鼻咽喉科，重庆 404100)

中耳胆脂瘤是耳外科常见的疾病之一，是一种良性的鳞状上皮角质化增生性病变。中耳胆脂瘤具有类似肿瘤的侵袭性生长、破坏骨质、复发等特性。关于中耳胆脂瘤的患病机制有多种学说，但仍不能完全解释其具有的独特生物学特性。

COX-2又称前列腺素过氧化物合成酶，是催化花生四烯酸合成前列腺素的关键酶，在大部分正常组织中通常不存在或表达水平很低，在炎症和肿瘤中呈高表达，参与肿瘤细胞的分化、增殖及转移，抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞生长和肿瘤血管形成。

PTEN

基因位于10q23.3染色体上，是目前发现的唯一具有磷酸酶活性的抑癌基因，编码具有403个氨基酸的同名蛋白。PTEN同时具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重活性，在抑制肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭、增殖、转移和凋亡具有重要作用。目前COX-2和PTEN的相关研究主要集中在恶性肿瘤，在中耳胆脂瘤中的研究报道极少。

本研究通过免疫组化和 Western blot 两种方法来检测COX-2和 PTEN在中耳胆脂瘤中的表达，探讨二者在中耳胆脂瘤产生过程中所发挥的作用以及二者的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本采集

收集2018年5月—2019年4月于西南医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科手术并经病理诊断的中耳胆脂瘤标本35例，其中男21例，女14例；年龄23～68岁，病程1～24年；中耳肉芽标本20例，男9例，女11例；年龄17～78岁，病程3个月至35年。随机收集上述患者的外耳道正常皮肤10例作为对照组，其中男6例，女4例；年龄35～69岁，病程2～18年。本实验患者签署知情同意书，并经医院伦理委员会同意。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化检测 将各组织石蜡块切片，二甲苯脱离，梯度乙醇水化。依次经过高温抗原修复、消除内源性过氧化物酶、山羊血清工作液封闭。加入一抗4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次，每次3 min。加入二抗，37 ℃条件下孵育20 min，PBS清洗3次，每次3 min。加辣根酶标记链霉卵白素反应液，37 ℃条件下孵育20 min，PBS清洗3次，每次3 min。室温下DBA显色15 min，蒸馏水冲洗。苏木素复染2 min，PBS冲洗。最后依次脱水、透明、封片。显微镜下观察并拍照。结果判读：以细胞浆内和/或细胞核内出现棕黄色染色为阳性，染色结果判断标准以华特波等方法按染色强度和细胞阳性百分率两项共同判断，随机选择5个高倍镜视野(400×)计分：①无染色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；②细胞阳性百分率<5%计0分，5%～25%计1分，25%～50%计2分，>50%计3分，两者之和：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，2～4分中等阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。每张切片于400倍高倍镜下随机选取5个阳性染色区域，分别测定其平均光密度值，取平均值作为标本测量的结果。

1.2.2 Western blot检测 向研磨成粉的组织中加入裂解液，裂解组织30 min，4 ℃下12 000 rpm离心10 min，收集上清，使用BCA法测定浓度。100 ℃煮10 min使蛋白变性，-20 ℃保存。配制10%的分离胶，5%的浓缩胶，SDS-PAGE电泳分离蛋白(分离胶120 V电泳1 h，浓缩胶60 V电泳30 min)。湿转的方式使蛋白转移到PVDF膜上。室温下5%的脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入稀释好的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5次，每次5 min。加入稀释好的二抗在室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL发光液发光，拍照、保存。用Image J软件处理图片，以目的条带与内参(GAPDH)条带灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

运用SPSS 22.0统计学软件对结果进行数据分析，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析进行组间差异比较，并进一步采用LSD-

t

和SNK检验进行组间两两比较。采用Pearson进行相关性分析。以

P

<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化

COX-2阳性表达主要定位于细胞浆内。COX-2在中耳胆脂瘤组染色呈强阳性染色，阳性细胞主要位于基底层；COX-2在中耳肉芽组呈强阳性表达,主要分布在新生的毛细血管及周围浸润的炎性细胞；COX-2在对照组呈弱阳性表达。见图1。中耳胆脂瘤组COX-2的平均光密度表达量高于中耳肉芽组及对照组，差异均具有统计学意义(

P

<0.01)；中耳肉芽组中COX-2的平均光密度表达量高于对照组，差异具有统计学意义(

P

<0.05)。见图2。

图1 各组中COX-2免疫组化染色结果 1A:COX-2在中耳胆脂瘤中呈强阳性表达 (SP ×400)；1B:COX-2在中耳肉芽中呈中度阳性表达 (SP ×400)；1C:COX-2在对照组呈弱阳性表达 (SP ×400) 图2 各组中COX-2的平均光密度 注：与对照组比较，*P<0.05，***P<0.001；与中耳肉芽组比较，##P<0.01。 图3 各组中PTEN免疫组化染色结果 3A:PTEN在中耳胆脂瘤中呈弱阳性表达 (SP ×400)；3B:PTEN在中耳肉芽组呈中等强度阳性表达 (SP ×400)；3C:PTEN在对照组呈强阳性表达 (SP ×400) 图4 各组中PTEN的平均光密度 注：与对照组比较，***P<0.001；与中耳肉芽组比较，##P<0.01。 图5 各组中COX-2和PTEN的Western blot蛋白检测结果 5A：各组中COX-2和PTEN的Western blot条带，GAPDH为内参；5B：各组中COX-2的相对表达；5C：各组中PTEN的相对表达 注：与对照组比较，*P<0.05，***P<0.001；与中耳肉芽组比较，##P<0.01，###P<0.001。

PTEN阳性表达主要位于细胞核。PTEN在中耳胆脂瘤组中呈弱阳性染色，阳性细胞主要位于基底层；PTEN在中耳肉芽组中呈中等强度阳性染色，阳性细胞散在分布在新生的毛细血管及周围的炎性细胞中；PTEN在对照组中呈强阳性染色，阳性细胞主要分布在上皮细胞的基底层和基底上细胞层。见图3。中耳胆脂瘤组中PTEN的平均光密度表达量低于中耳肉芽组和对照组，差异具有统计学意义(

P

<0.01)；但中耳肉芽组中PTEN的平均光密度表达量与对照组无明显统计学差异(

P

>0.05)。见图4。

2.2 Western blot

中耳胆脂瘤组COX-2表达高于中耳肉芽组和对照组，差异具有统计学意义(

P

<0.01)；中耳肉芽组COX-2表达高于对照组，差异具有统计学意义(

P

<0.05)。中耳胆脂瘤组PTEN表达低于中耳肉芽组和对照组，差异具有统计学意义(

P

<0.001；

P

<0.001)；但中耳肉芽组中PTEN表达与对照组无明显统计学差异(

P

>0.05)。见图5。

2.3 COX-2与PTEN在中耳胆脂瘤组中的相关性分析

通过Pearson相关性分析对以上数据分析，中耳胆脂瘤组中COX-2和PTEN的免疫及蛋白表达呈显著负相关(

P

<0.05)。见图6、7。

图6 COX-2与PTEN免疫组化结果相关性散点图 图7 COX-2与PTEN Western blot结果相关性散点图

3 讨论

中耳胆脂瘤侵袭性生长可破坏周围骨质，引起如化脓性脑膜炎、乙状窦血栓性静脉炎、面瘫、迷路炎等多种颅内外并发症，严重时可危及患者的生命。但由于中耳胆脂瘤具体致病机制复杂，至今未明确。近年研究方向主要集中在细胞增殖和细胞凋亡等方面，此次也从以上方面入手，旨在通过相关途径的研究进一步探讨中耳胆脂瘤的致病机制。

3.1 COX-2与中耳胆脂瘤

COX-2由癌症相关的成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs)释放，能促进癌细胞的凋亡抵抗、增殖、血管生成、炎症、侵袭和转移。研究发现，COX-2通过调节包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在内的多种血管生长因子调控肿瘤新生血管的形成，促进肿瘤的生长。VEGF被广泛认为是血管生成的主要诱导因子，在新生血管形成和促进血管通透性增加中有重要作用。典型的肉芽组织主要由增生的成纤维细胞、新生毛细血管和炎性细胞(白细胞)浸润共同组成。本研究结果显示：在中耳肉芽组织中COX-2表达增加，且主要位于毛细血管及炎性细胞中，提示COX-2过表达可通过促进新生血管形成参与中耳肉芽组织的形成。COX-2的过表达能上调Bcl-2蛋白的表达，Bcl-2蛋白能抑制Caspase凋亡通路，从而抑制细胞凋亡，促进肿瘤的生长。Jeong等研究发现，COX-2可产生或诱导产生基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9，MMP-9)，MPP-9可以裂解多种细胞外基质，在癌细胞侵袭和肿瘤转移中起着至关重要的作用。本研究结果显示，与正常外耳道皮肤相比，COX-2在中耳胆酯瘤中明显高表达，提示COX-2高表达可能通过抑制细胞凋亡、促进毛细血管的生成及骨质的破坏参与了中耳胆脂瘤的发生、发展。

3.2 PTEN与中耳胆脂瘤

PTEN研究发现，PTEN低表达或表达缺失与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关，如乳腺癌、结肠癌和子宫内膜癌等。本研究结果显示相对于正常外耳道皮肤，PTEN在胆脂瘤上皮中表达量明显降低，提示PTEN的低表达可能在中耳胆脂瘤的发生发展中发挥重要作用。刘东亮等研究发现，PTEN在中耳胆脂瘤中的表达低于正常皮肤组织，考虑PTEN与胆脂瘤上皮的高度增殖和抗凋亡密切相关。与本研究不同，汪欣等发现，PTEN在胆脂瘤上皮与外耳道皮肤的表达无显著差异，作者认为PTEN是维持胆脂瘤上皮细胞正常生理状态而不是引起上皮细胞的异常增殖。殷团芳等研究发现在胆脂瘤上皮和正常外耳道皮肤中，PTEN阳性表达主要位于细胞核，且与正常外耳道皮肤比较，胆脂瘤上皮中PTEN呈明显低表达，本研究结果与其一致。

磷脂酰肌-3激酶/丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路是体内参与细胞凋亡相关的重要代谢通路。PTEN是PI3K/Akt信号通路的关键负性调控因子，通过磷酸化3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，降低细胞内PIP3水平，抑制PI3K和Akt异常激活，阻断所有受Akt信号调节的下游通路,从而抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。当PTEN表达降低，PI3K/Akt通路激活，从而增加Akt的表达,Akt通过多种途径使细胞凋亡因子失活与增加抗凋亡蛋白的活性。有研究发现，沉默人角质形成细胞的

PTEN

基因后，角质形成细胞将出现类似中耳胆脂瘤样的异常增殖。本实验结果显示：与正常外耳道皮肤相比，中耳胆脂瘤中PTEN的表达明显降低。我们推测在中耳胆脂瘤形成过程中，PTEN低表达导致细胞异常增殖和抗凋亡，PI3K/Akt作为信号通路参与了这一过程。

3.3 COX-2与PTEN的相互作用

本研究显示在中耳胆脂瘤中COX-2与PTEN表达呈显著负相关，同样的结果也在子宫内膜癌、乳腺癌中报道。目前尚无COX-2和PTEN在中耳胆脂瘤相关性的研究。Chang等发现，在结肠癌中COX-2过表达能靶向降低PTEN的表达，而使用COX-2抑制剂后，PTEN表达显著升高，细胞凋亡率增加，侵袭和增殖能力显著降低。研究发现在子宫内膜癌细胞中，抑制Akt活性时，COX2表达下降，上调Akt活性时，COX-2表达增加，提示Akt可调节COX-2的表达。PI3K/Akt信号可被PTEN负调控，而COX-2是PI3K/Akt信号通路的下游靶点信号之一。推测在中耳胆脂瘤的形成过程中，PTEN与COX-2可能通过PI3K/Akt信号通路相互调控，抑制胆脂瘤上皮细胞的凋亡，促进胆脂瘤上皮的增殖和侵袭，从而导致中耳胆脂瘤的发生、发展。综上，PTEN的低表达和COX-2的过表达与中耳胆脂瘤的发病有密切关系。二者在中耳胆脂瘤中表达呈负相关，可能通过PI3K/Akt信号通路相互调控，但二者之间具体的调控机制，尚需我们进一步研究。