焦亡与缺血性脑卒中关系的研究进展

鲁明 郭帅 刘恒兴

[摘要]焦亡是一种炎症类型的程序性细胞死亡方式，发生于炎症小体激活后。焦亡直接由最近发现的一个被称为Gasdermin（GSDM）的成孔蛋白家族调节，其最具特征的是Gasdermin D（GSDMD）。最近的研究表明焦亡与多种神经系统病变的发病机制有关，尤其在缺血性脑卒中的病理发展中，焦亡有广泛的参与。本文主要讨论诱发焦亡的分子机制和发生缺血性脑卒中时焦亡的分子靶点，以期为缺血性脑卒中后脑损伤的治疗及预后提供新的策略。

[关键词]焦亡;炎症小体;Gasdermin D;缺血性脑卒中

[中图分类号] R743.3  [文献标识码] A   [文章编号]2095-0616（2022）08-0060-04

Research progress on the relationship between pyroptosis andischemic stroke

LU  MingGUO  ShuaiLIU  Hengxing1

1. Department of Human Anatomy and Histoembryology， Xinxiang Medical University， Henan， Xinxiang 453000， China;2. Laboratory ofHuman Anatomy， Sanquan College ofXinxiang Medical University， Henan， Xinxiang 453000， China   [Abstract] Pyroptosis is a type of inflammatory programmed cell death that occurs after the activation of inflammasome. Pyroptosis is directly regulated by a recently discovered pore-forming protein family called gasdermin （GSDM）， the most characteristic of which is gasdermin D （GSDMD）. Recent studies have shown that pyroptosis is related to the pathogenesis of a variety of nervous system diseases， especially the ischemic stroke. This paper mainly discusses the molecular mechanism of inducing pyroptosis and the molecular targets of pyroptosis in ischemic stroke， in order to provide a new strategy for the treatment and prognosis of brain injury after ischemic stroke.

[Key words] Pyroptosis; Inflammasome; Gasdermin D; Ischemic stroke

程序性細胞死亡是一种大脑发育、维持体内激素水平以及清除感染或转化细胞的重要特征。程序性细胞死亡存在12种类型，从非炎症性（如凋亡）至高度促炎性（如焦亡），每种类型由独特的分子特征定义。程序性细胞死亡从根本上不同于坏死，坏死是瞬间的、灾难性的，无法通过药理学或基因干预口。

细胞凋亡是由微环境的扰动引起的并由半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）活化，主要是caspase-3 的活化，这类细胞死亡方式在中枢神经系统中已被深入研究2]。然而非凋亡性炎性细胞死亡作为神经退行性变的重要决定因素越来越受到重视，特别是促炎症和溶解性细胞程序性死亡一焦亡，已成为神经系统疾病的关键因素，与很多神经系统疾病相关，如缺血性脑卒中。了解焦亡和这类疾病的关系，探索缺血性脑卒中的细胞死亡途径是开发有效治疗方法的基础。

1 焦亡的分子机制

与凋亡不同，焦亡是溶解性、促炎症的，其特征是形成损害膜完整性的膜孔。焦亡依赖于细胞死亡的执行者-Gasdermin（GSDMD）蛋白质，其中 GSDMD蛋白的发现，将人们对焦亡的认识引领到一个新的高度13—51。此外，焦亡是由caspase—1引起的，Caspase—1在形成炎症小体的细胞溶质多聚体平台上被激活，这种分子主要通过保守蛋白质结构域之间的相互作用获得[6—71，它们是炎症小体激活焦亡下游的主要驱动因素。炎症小体分为标准的或非标准的，具体取决于caspase—1是否与之结合，炎症小体的激活是介导后续GSDMD蛋白活化和细胞焦亡的关键步骤。标准和非标准的炎症小体都可以直接介导GSDMD裂解18—121，因此可在GSDMD介导的细胞焦亡的分裂中充当重要的检查点。

最初使用人和小鼠细胞确认GSDMD为焦亡刽子手是为了回应经典和非经典炎症小体活化113—15]。多项研究证实了GSDMDN端活化具有成孔的能力，而 GSDMD C 端自身抑制性作用也被提出[16-20]。虽然 GSDMD 在许多细胞类型中均有表达，但转录因子干扰素调节因子2（interferon regulatory factor 2， IRF2）可控制 GSDMD 的转录表达，其转录上调在某些细胞类型中是必需的，以提高蛋白质水平，诱导焦亡[21]。但在中枢神经系统，IRF2是否是驱动 GSDMD 表达的唯一转录因子，以及它是否是 GSDMD 介导焦亡的重要调节因子目前尚不清楚。虽然 GSDMD 家族的其他成员最近已经被确定（如 GSDME），但 GSDMD 是焦亡最显著的特征，仍是本文讨论的重点。

2焦亡途径

从历史上看，是否依赖 caspase-1家族蛋白酶被认为是焦亡的定义特征。发现 GSDMD 后，对焦亡的定义进行了修订，包括依赖 GSDMD 作为必需的分子特征和依赖 caspase-1家族两种特性，但也发现其他 caspase 家族成员，包括 caspase-3和 caspase-8也可以处理 GSDMD，导致焦亡。 Caspase-8在活化转化生长因子（TGF）b-抑制激酶-1（TAK1）的情况下切割并激活 GSDMD，促使对依赖于 caspase-1家族蛋白酶的焦亡的定义进行重新评估。在体外，重组 caspase-8可裂解小鼠和人的 GSDMD，尽管效率低于重组 caspase-1[5]。正如对神经营养体的几项研究发现所强调的那样，如丝氨酸蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶 G，也可以在附近切割 GSDMD caspase-1/4裂解位点，释放具有生物活性的 P30 N 末端区域。

虽然 caspase-8可以切割并激活 GSDMD 和 GSDME，从而导致焦亡[5]，而 caspase-3只能通过切割 GSDME 来导致焦亡，且 caspase-3-GSDME 途径介导焦亡的主要途径见于有关癌症文献报道中[3]， GSDME 也被确定为暴露于凋亡刺激后的二次坏死机制。这些焦亡途径在中枢神经系统中活跃的细胞类型有待确定。

3 GSDMD的结构与功能

人类 GSDMD 含有242个氨基酸（amino acid， AA）N 末端结构域和199个 AA C 末端结构域[22]。 GSDMD 的两个结构域是构成自身抑制机制的基础，其中 C 末端结构域组成性地与 N 末端结构域相互作用并抑制 N 末端结构域。在被 caspase-1/4切割后， C 末端的自身抑制作用被去除，释放形成孔的 P30N 末端片段。N-GSDMD 的实验性过表达单是片段就足以激活焦亡[13]，在质膜上脂质结合触发 N-GSDMD 寡聚形成跨膜孔。这些气孔潜在性破坏了局部渗透压，导致肿胀、膜破裂和溶解，迅速将细胞内容物释放到细胞外环境。利用原子力和电子显微镜，很多课题组已经观测到 GSDMD 裂解后数分钟内 N 端就会形成膜孔[16]。决定 GSDMD 孔的形成因素是否会导致活细胞释放细胞因子或致细胞焦亡目前仍在调查中。

4中枢神经系统细胞焦亡

在不同的中枢神经系统细胞群中，使用各种不同的免疫组化方法对炎症小体激活和焦亡进行了评估。虽然并非所有类型的细胞都能合成促炎因子白细胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）和白细胞介素-18（interleukin-18， IL-18）[23]，但事实上所有类型的细胞暴露于促炎症刺激物时，均会过度激活炎症小体，在特定情况下发生焦亡。本文特别关注的是中枢神经系统脑巨噬细胞样细胞（brain  macrophage-like cells，BMC）发生炎症时的焦亡证据。

BMC 包括常驻的小胶质细胞、血管周围细胞、脉络丛细胞和脑膜巨噬细胞，这些细胞可以被神经炎症高度诱导，在稳态条件下表达炎症体成分。Nod 样受体蛋白（Nod-like receptor pyrin  domain， NLRP）炎症小体诱导的炎症反应与神经变性疾病关系密切，其在缺血性脑卒中扮演的炎症损伤角色也日益引起重视。在基线水平人类胚胎组织中的小胶质细胞，表达 NLRP1、凋亡相关斑点樣蛋白（apoptosis-associated speck-like  protein containing CARD， ASC）、黑色素瘤缺乏因子2（absent inmelanoma 2， AIM2）和 caspase-1转录。而 NLRP3转录在暴露于启动刺激时可被诱导，在人类胚胎小胶质细胞中可诱导 caspase-1裂解和 IL-1β成熟，以响应多种 NLRP3炎症体激活刺激物。并且在人类小胶质细胞暴露于 NLRP3炎性体激活刺激物后的炎性体激活下游发现 GSDMD 依赖性焦亡。

5缺血性脑卒中的炎症小体和焦亡

自从2002年发现炎症小体以来，这一途径一直被认为与神经系统发病机制有关。最近研究显示，当发生缺血性脑卒中时，在缺血半暗带的脑细胞焦亡的上游分子高表达，提示焦亡在脑缺血损伤发展中的重要作用。细胞焦亡时释放大量胞内容物和促炎介质（如 IL-1β、IL-18等）[23]，诱导级联放大的炎症反应。细胞焦亡的信号途径、关键分子靶标逐渐得到认识，正在成为缺血损伤研究的新热点。2018年Pon等[24]研究发现，当缺血性中风激活小胶质细胞后， NLRP1、NLRP3、NLRC4和 AIM2炎性小体蛋白分子的表达增多、活化增强。用免疫印迹分析表明小胶质细胞在缺血条件下可释放炎性小体和激活的促炎因子，而后介导炎症反应和本身的焦亡。

炎症小体成分（包括炎症小体相关细胞因子、NLRP1、NLRC4、ASC和caspase-1/11）在多种缺血性脑损伤模型中具有保护作用，但并非所有研究都认为炎症小体抑制具有保护作用1251。可能在早期（梗死后30min内）神经元 caspase-1和caspase-3 被激活，如caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk可阻止体内 caspase—3的激活。血栓栓塞性卒中后，神经元和巨噬细胞和/或小胶质细胞对各种炎症组分（包括NLRP1、ASC和caspase-1）均呈免疫阳性;缺血性中风后也检测到NLRP2免疫阳性星形胶质细胞126]。局灶性脑缺血已被证明在缺血半暗带区上调IL—1β和IL—18，下游小胶质细胞TREM—1受体和激酶SYK的表达增高，且伴随GSDMD增加表达和裂解。正如所证明的，小胶质细胞和/或巨噬细胞特异性蛋白抗体（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1）导致BMC特别容易发生细胞焦亡，通过Iba—1与GSDMD的共定位和透射电子显微镜证明在细胞质膜中存在GSDMD孔的分布。

6 小結

本文强调了GSDMD作为驱动因素的焦亡的关键进展，促炎症细胞程序性死亡—焦亡和缺血性脑卒中的关系，以及在今后的研究中，必须着力解决的几个重要问题。如促炎症反应与缺血性脑卒中的细胞因子产生和焦亡，需要进一步研究GSDMD在细胞因子释放和代谢中的功能，探索清楚这一具有挑战性的细胞死亡方式。此外，中枢神经系统的独特特性，包括长寿命、终末分化、更新能力低等，以及精细和复杂的组织结构，可能激发对炎症刺激的独特反应。目前的研究证据表明通过阻止细胞焦亡可减轻缺血性脑卒中的发生发展，通过靶向干预细胞焦亡有望使缺血性脑卒中在治疗上取得新的突破，有望在未来成为阻断缺血性脑卒中进展的有效治疗方法，但目前的研究多以机制研究为主，且多在细胞和动物水平上进行，接下来可完善已有的研究成果，进一步加强细胞焦亡相关过程与缺血性脑卒中关系的临床研究，为缺血性脑卒中的治疗提供更有效的策略。

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（收稿日期：2021-11-26）