通过式固相萃取结合UPLC-MS/MS同时测定烟用水基胶中的烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮

孟冬玲，陈志燕，王维刚，朱文静，周芸，唐纲岭，杨飞*

通过式固相萃取结合UPLC-MS/MS同时测定烟用水基胶中的烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮

孟冬玲1，陈志燕1，王维刚1，朱文静2，周芸1，唐纲岭3，杨飞3*

1广西中烟工业有限责任公司技术中心，南宁市北湖南路28号 530001；2贵州省烟草质量监督检测站，贵阳市金阳新区云潭北路烟草科技大楼 550025；3国家烟草质量监督检验中心，郑州高新技术产业开发区翠竹街6号 450001

【】建立通过式固相萃取结合超高效液相色谱‒串联质谱（UPLC‒MS/MS）同时测定烟用水基胶中烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮杀菌剂的方法。样品用甲醇提取，经PRiME HLB通过式固相萃取净化后，以 ACQUITY UPLC HSS C18SB (100 mm×3.0 mm, 1.8 μm)为色谱柱，水和甲醇为流动相进行梯度洗脱。所有分析物回收率在86.6%～104.4%之间，日内精密度为1.5%～5.6%，日间精密度为2.3%～5.1%。在8～800 ng/mL的浓度范围内所有化合物均有良好的线性关系（2≥0.9991），检出限(LOD)和定量限（LOQ）范围分别为0.17～0.62 mg/kg和0.54～1.94 mg/kg。该方法快速、准确、选择性强，可用于烟用水基胶样品中烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮杀菌剂的同时测定。

烟用水基胶；超高效液相色谱‒串联质谱；通过式固相萃取；异噻唑啉酮；烷基酚；烷基酚聚氧乙烯醚

烷基酚（alkylphenol，AP）和烷基酚聚氧乙烯醚（APEO）具有良好的乳化、润湿、渗透性能及起泡、洗涤、去污等作用，广泛应用于抗氧剂、纺织印染助剂、润滑油添加剂、农药乳化剂、树脂及橡胶稳定剂等领域。AP和APEO具有内分泌干扰效应，属于环境内分泌干扰物（endocrine disrupting compound, EDC）[1-3]，可以通过食物链富集，易对生态环境造成危害。异噻唑啉酮杀菌剂，是一类新型高效广谱防腐杀菌剂，广泛用于化妆品、涂料、胶粘剂、制浆造纸等行业。异噻唑啉酮类化合物对眼睛、皮肤有致敏反应，并具有神经毒性和细胞毒性[4]。因此，我国的《化妆品安全技术规范》明确规定双酚A、壬基苯酚与支链4-壬基苯酚为化妆品中的禁用物质，2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MI）的残留限量为0.01%（即100 mg/kg），5-氯-2-甲基-异噻唑啉-3-酮（CMI）和MI的混合物（3:1）的残留限量为0.0015%（即15 mg/kg），计算为CMI的残留限量要求为11.25 mg/kg；同时规定，在同一产品中，使用CMI和MI的混合物，就不能再单独使用MI[5]。中国烟草总公司企业标准YQ 5—2019《烟用胶粘剂安全卫生要求》明确要求卷烟接嘴水基胶、滤棒中线水基胶中壬基酚和辛基酚之和应小于10 mg/kg，壬基酚、辛基酚、壬基酚聚氧乙烯醚和辛基酚聚氧乙烯醚之和应小于100 mg/kg，MI含量不得超过100 mg/kg，CMI含量不得超过10 mg/kg，1,2-苯并异噻唑基-3(2H)-酮（BIT）不得超过240 mg/kg[6]。

烟用水基胶是一种由可以溶解或分散于水中的成膜材料制成的胶黏剂，为了使得水基胶均一性更好，烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚常作为乳化剂加入到水基胶中，并且为了防止水基胶变质会加入异噻唑啉酮杀菌剂。目前，烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮杀菌剂的分析方法主要有高效液相色谱法[7-9]及液相色谱-质谱法[10-15]等，且均是针对烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚或异噻唑啉酮类杀菌剂的单一分析方法，尚未见同时测定烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮类杀菌剂的文献报道。

由于烟用水基胶基质复杂，需要对样品进行净化以最大程度地减少共提取物。分散固相萃取、固相萃取等多种样品前处理技术已经应用于水基胶中烷基酚和异噻唑啉酮类杀菌剂的测定。但是这些技术操作繁琐或需要大量的有机溶剂。PRiME HLB固相萃取柱是一种新型的亲水亲油平衡固相萃取柱，无需活化和清洗，可以在通过式固相萃取模式下使用，操作简单，效率高，目前已应用于多种复杂样品的净化[16-18]。

本文通过式固相萃取与超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）相结合，通过优化分析物的质谱和色谱条件，实现了烟用水基胶中烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮杀菌剂的同时测定。该方法提高了样品检测速度，操作简单且灵敏度高、特异性强，能很好地满足烟用水基胶中烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮杀菌剂同时测定的需求。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

所有烟用水基胶样品采集于不同的生产厂家并储存于棕色顶空瓶中，于4 ℃下保存。其中1#、2#、3#样品为搭口胶，4#、5#、6#样品为接嘴胶，7#、8#样品为中线胶，9#、10#样品为包装胶。

4-正辛基酚（4-n-OP，CAS：1806-26-4，纯度97.0%）、4-正壬基酚（4-n-NP，CAS：104-40-5，纯度97.0%）、辛基酚聚氧乙烯醚（OPnEO）标准品、壬基酚聚氧乙烯醚（NPnEO）标准品（纯度>98％，平均聚合度n=9，上海安谱实验科技股份有限公司）；2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-异噻唑啉-3-酮、1,2-苯并异噻唑基-3(2H)-酮（纯度>98.5％，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮-3（MI-3）、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮-3（CMI-3）、1,2-苯并异噻啉-3-酮-136（BIT-136）（纯度>98.0％，天津阿尔塔科技有限公司）；甲醇（色谱纯，韩国DUKSAN公司）；液氮（>99.99%，郑州源正科技发展有限公司）；PRiME HLB 固相萃取柱（60 mg, 3 mL）（美国Waters公司）；水为超纯水。

ACQUITY I class超高效液相色谱仪、Xevo-TQS四极杆串联质谱仪(配有电喷雾电离源)、ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱（100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）（美国Waters公司）；AEl63电子天平（感量：0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；KQ5200 DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 内标工作溶液的配制

分别称取10 mg的M-3、CMI-3和BIT-136标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到质量浓度均为100 μg/mL的内标工作溶液。内标工作溶液避光储存在-20℃的冰箱中。

1.2.2 标准工作溶液的配制

分别称取10 mg的AP、APEO和异噻唑啉酮类杀菌剂标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到质量浓度均为1.0 mg/mL的一级混合标准储备液。移取100mL的上述一级混合标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到AP、APEO和异噻唑啉酮类杀菌剂质量浓度均为10.0 μg/mL二级混合标准储备液。分别移取上述二级混合标准储备液2000、1000、500、200、50和20 μL至6个25 mL容量瓶中，并分别加入20mL的内标工作溶液，用甲醇定容至刻度，制得不同质量浓度的标准工作溶液。各标准工作溶液中AP、APEO和异噻唑啉酮类杀菌剂的质量浓度分别为800、400、200、80、20和8 ng/mL。所有溶液避光储存在-20℃的冰箱中。

1.2.3 样品前处理及分析条件

前处理过程：称取0.3 g样品置于玻璃三角瓶中，加入5 mL超纯水，涡旋振荡，使水基胶样品分散在水中；向三角瓶中加入20 mL的甲醇和100mL的内标工作溶液，超声提取30 min；将上清液（3 mL）转移至PRiME固相萃取柱，并在重力作用下通过该柱。收集流出液并过0.22 μm有机相滤膜。滤液（200 μL）用800 μL甲醇稀释后进UPLC‒MS/MS分析。

1.2.4 UPLC‒MS/MS分析条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱（100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）；柱温：30℃；进样量：5 μL；样品室温度：10℃；流动相流速：0.3 mL/min；流动相：A为甲醇，B为水，梯度洗脱程序：0～4 min A和B的体积比由5%：95%变成60%：40%；4～5 min A和B的体积比由60%：40%变成95%：5%；5～8.9 min A和B的体积比维持95%：5%；8.9～9.0 min A和B的体积比由95%：5%变成5%：95%；9.0～10 min A和B的体积维持为5%：95%。

毛细管电压：2.8 kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气流量：800 L/h；脱溶剂气温度：300℃；碰撞气：氩气，压力0.05 MPa; 锥空气：氮气，流量65 L/h；驻留时间：100 ms；AP采用负离子扫描；APEO和异噻唑啉酮类杀菌剂采用正离子扫描；离子源：电喷雾电离源（ESI）；采集模式：多反应监测（MRM）；其他质谱参数见表1。

表1 分析物的质谱参数

注：*为定量离子对。

Note:*Quantitative ion pair.

1.2.5 数据分析

平均值、回收率和相对标准偏差的计算采用Origin8.5版软件；数据采集采用Mass Lynx 4.1软件（美国Waters公司）。通过加和不同聚合度的OPnEO或NPnEO所有定量离子的峰面积对OPnEO或NPnEO进行定量分析。烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚采用外标法定量，异噻唑啉酮杀菌剂采用同位素内标法定量。

2 结果和讨论

2.1 实验条件优化

2.1.1 质谱条件的优化

通过蠕动泵注入200 ng/mL的AP、APEO和异噻唑啉酮类杀菌剂标准混合溶液，在ESI+和ESI‒模式下进行全扫描，通过对比，发现烷基酚在ESI-模式下有较高的响应值和对称的峰形。这是因为4-正辛基酚和4-正壬基酚分子结构中均含有酚羟基，在ESI‒电离方式下，可获得较高丰度的[M-H]‒母离子。相反，APEO和异噻唑啉酮类杀菌剂在ESI+模在式下有较高的响应值和对称的峰形。MI、CMI和BIT属于极性、大分子有机物，其分子结构中均有含氮基团，有利于结合质子得到[M+H]+离子，因此选择正离子模式进行检测。辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚均含有醚氧基团，在正离子模式下容易形成[M+NH4]+、[M+H]+、[M+Na]+的母离子，其分子离子峰主要为[M+NH4]+。相邻聚合度的辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚间隔1个乙氧基，相对分子质量相差44。OPnEO分子离子主要分布为m/z（224+44n）（n=3～16），NPnEO分子离子主要分布为m/z（238+44n）（n=3～16）。在多反应监测（MRM）正离子模式下优化各种质谱参数，优化后得到的各化合物的质谱参数见表1。

2.1.2 流动相的优化

根据文献报道[10-12]，正离子扫描模式下，在流动相中添加醋酸铵能显著增加烷基酚聚氧乙烯醚的信号强度，但是烷基酚的离子强度会被明显抑制。而烷基酚通常采用负离子扫描模式，并在流动相中添加氨水增加烷基酚的信号强度。由于水基胶中烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮的残留限量均超过10 mg/kg。本文选用纯水-甲醇为流动相，虽然烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚的质谱响应有所降低，但是其检测限均可满足产品的限量要求，且在正、负离子扫描模式下均采用水-甲醇为流动相可以方便实验操作，不需要更换流动相。

2.1.3 色谱柱的选择

对比了ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS C18SB色谱柱（100 mm×3.0 mm, 1.8 μm）、ACQUITY UPLC CSH Fluoro‒Phenyl色谱柱（75 mm×2.1 mm, 1.7 μm）三种不同色谱柱对烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮类杀菌剂的分离效果。以4-正壬基酚为例（图1），以ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl为色谱柱，4-正壬基酚响应较差，以ACQUITY UPLC BEH C18柱和ACQUITY UPLC HSS C18SB柱进行分离，4-正壬基酚响应相当，但是以ACQUITY UPLC BEH C18柱分离时，基线漂移，综合考虑，实验中选择ACQUITY UPLC HSS C18SB色谱柱进行分离。

注：a. ACQUITY UPLC HSS C18 SB柱；b. ACQUITY UPLC CSH Fluoro‒Phenyl柱；c. ACQUITY UPLC BEH C18柱。

2.1.4 稀释倍数对基质效应的影响

在HPLC-MS/MS分析过程中，共洗脱物会影响分析物的离子化，这种现象称为基质效应。基质效应分为基质抑制和基质增强，基质抑制使分析物的质谱响应降低，而基质增强则使分析物的质谱响应增加。检测和评估基质效应主要有提取后添加法和柱后灌注法。

本文以实际样品（1#）为研究对象，采用提取后添加法考察了不同稀释倍数下各化合物的基质效应（ME），基质效应按下列公式计算[19-21]：

其中加标指的是样品提取液配制的待测物加标浓度为500 ng/mL溶液中各待测物的峰面积；样品指的是未加标前样品提取液中各待测物的峰面积；甲醇指的是纯甲醇配制的含待测物浓度为500 ng/mL的溶液中各待测物的峰面积。

当ME在-20%～+20%之间时，基质效应不明显，可以忽略不计；当ME大于20%时为基质增强效应，小于-20%则为基质抑制效应。如表2所示，随着稀释倍数增加，所有分析物的基质效应在逐渐降低，当稀释5倍时烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚的基质效应在-3.0%～-5.2%之间，此时基质效应对烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚定量的影响可以忽略。但是CMI和BIT的基质效应在-57.4%～-60.1%之间，基质对异噻唑啉酮的响应仍有较强的抑制效应。其他类型的水基胶也有同样的效果，随着稀释倍数增大，基质效应减弱。由于稀释倍数的增加会减低方法的灵敏度，因此本文将样品稀释5倍后进样分析，同时采用同位素内标法对异噻唑啉酮进行定量。

表2 稀释倍数对基质效应的影响

Tab.2 The influence of dilution factor on matrix effect

2.2 方法评价

2.2.1 线性方程、检出限和定量限

在优化的条件下，对配制好的一系列不同浓度的混合标准工作溶液进行测定，以分析物的定量离子峰面积对其质量浓度绘制标准工作曲线。标准工作曲线的形式为=+，其中和分别表示为斜率和截距。线性方程和可决系数见表3，结果表明，在8～800 ng/mL浓度范围内，分析物的浓度和定量离子的峰面积具有良好的线性关系（2≥0.9991）。将加标空白水基胶萃取溶液中产生的信噪比(S/N)等于3和10时的浓度分别定义为检出限（LOD）和定量限（LOQ），分析物的LOD和LOQ分别在0.17～0.62 mg/kg和0.54～1.94 mg/kg之间。

表3 烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮杀菌剂的线性方程，检出限和定量限

Tab.3 Regression equation, LOD and LOQ for AP, APEO and Isothiazolinone fungicide

2.2.2 方法回收率及精密度

通过实际样品（1#）的加标回收实验来测试方法的准确度和精密度，该方法的精密度由重复性实验确定，并以表示。实际样品经过上述方法测定后，根据其实际含量确定加标量，加标量为实际含量的0.5、1.0和2倍。按照上述方法对加标样品进行处理，每个浓度的样品重复测定5次，连续测定3 d。结果（表4）显示，在所有浓度水平下均获得令人满意的回收率(86.6%～104.4%)，日内精密度为1.5%～5.6%，日间精密度为2.3%～5.1%。

表4 方法的精密度和准确度

Tab.4 Accuracy and precision of the proposed method

2.2.3 方法对比

采用建立的UPLC-MS/MS法与相应的标准分析方法进行比对[9,15]。分别采用本方法和标准方法对实际样品（1#）重复测试5次，并以检验来评价两种不同方法之间的差异。同时考察了不同方法之间的灵敏度、回收率和精密度。结果如表5所示，所有化合物||<双尾临界=2.78，双尾>0.05，本方法与标准方法的测量结果之间无显著性的差异，回收率和精密度相当。与标准方法相比，该方法对于烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚有更高的灵敏度。标准方法YQ/T86—2018中异噻唑啉酮类杀菌剂的分离时间为15 min，YQ/T71—2015烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚的分离时间为25 min，而本方法能同时检测异噻唑啉酮类杀菌剂、烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚，且分离时间仅为10 min，大大提高了检测通量。

表5 不同方法测定结果对比

Tab.5 Comparison of determination results by different methods

2.2.4 实际样品检测

采用本方法和标准方法[9,15]对10个不同品牌的烟用水基胶样品进行了测定。结果（表6）显示：所有样品均不同程度含有MI、CMI和BIT三种异噻唑啉酮类杀菌剂。本方法测定MI、CMI和BIT的含量分别在28.19～89.05 mg/kg、1.54～8.84 mg/kg和35.40～120.45 mg/kg之间，标准方法测得结果在30.11～90.12 mg/kg、1.60～8.64 mg/kg和36.65～119.59 mg/kg之间。另有1个样品同时检出辛基酚、壬基酚、辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚，2个样品检出壬基酚聚氧乙烯醚。图2为实际样品（1#）的选择离子色谱图。

表6 实际样品测定结果

Tab.6 Determination results of samples

注：“/”表示未检出。

Note: “/”means not detected.

图2 实际样品(1#)的UPLC‒MS/MS色谱图

3 结论

本文结合通过式固相萃取建立了超高效液相色谱‒串联质谱同时检测烟用水基胶中烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮类杀菌剂的分析方法，并对质谱条件和色谱条件进行了优化。在优化的条件下，可在10 min内实现基线水基胶中烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮类杀菌剂的同时检测，且前处理简单、快速。所有分析物的回收率在86.6%～104.4%之间。该方法可满足实验室中大批量烟用水基胶样品的准确、快速测定。

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Simultaneous determination of alkylphenols, alkylphenol polyoxyethylene ethers and isothiazolinones in water-based adhesives of cigarette by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry combined with pass-through SPE

MENG Dongling1, CHEN Zhiyan1, WANG Weigang1, ZHU Wenjing2, ZHOU Yun1, TANG Gangling3, YANG Fei3*

1 China Tobacco Guangxi Industrial Co., Ltd., Nanning 530001;2 Guizhou Province Tobacco Quality Supervision Station, Guiyang 550025;3 China National Tobacco Quality Supervision & Test Center, Zhengzhou 450001

To realize the determination of alkylphenols, alkylphenol ethoxylatesand isothiazolinones in water-based adhesivesof cigarette, ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) analytical method combined with pass-through solid phase extraction was established.The sample was extracted with methanol and purified by a PRiME HLB pass-through solid-phase extraction, followed by separation treatment with ACQUITY UPLC HSS C18 SB (100 mm×3.0 mm, 1.8 μm) chromatographic column using water and methanol as mobile phases.The results showed that: within 12 minutes, all analytes were eluted; under optimized conditions, the recoveries for all compounds were 80.8%-95.5%, with relative standard deviations (RSDs) less than 7.0%. Good coefficients of determination (2≥0.9991) were achieved for all studied analytes. The LOD for all analytes varied from 0.17-0.62 mg/kg and the LOQ varied from 0.54-1.94 mg/kg.The results confirm that the proposed method is stable and reliable, and can be used to determine alkylphenols, alkylphenol polyoxyethylene ethers and isothiazolinones in water-based adhesives of cigarette.

alkylphenols; alkylphenol polyoxyethylene ethers; isothiazolinones; pass-through solid phase extraction; water‒based adhesives; ultra performance liquid chromatography‒tandem mass spectrometry

. Email：Yangfei0797@163.com

孟冬玲，陈志燕，王维刚，等.通过式固相萃取结合UPLC-MS/MS同时测定烟用水基胶中的烷基酚、烷基酚聚氧乙烯醚和异噻唑啉酮[J]. 中国烟草学报，2022，28（2）. MENG Dongling, CHEN Zhiyan, WANG Weigang, et al. Simultaneous determination of alkylphenols, alkylphenol polyoxyethylene ethers and isothiazolinones in water-based adhesives of cigarette by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry combined with pass-through SPE[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(2).doi:10.16472/ j.chinatobacco.2021.T0037

中国烟草总公司标准制修订项目（2021QB016）

孟冬玲（1975—），硕士，高级工程师，研究方向：样品前处理方法研究，Email：1694201009@qq.com

杨飞（1985—），硕士，高级工程师，研究方向：烟用材料检验方法研究，Email：Yangfei0797@163.com

2021-03-15；

2022-03-15