猪精不同冻融方法效果对比

周 健 ，曹婷婷 ，2，曹俊新 ，赵云翔 ，2＊

（1.广西贵港秀博基因科技股份有限公司，广西 贵港 537100；2.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山528000）

1 前言

随着养猪业的不断发展，人工授精技术在养猪业中不断推广和应用，很大程度上提升了生产效率和公猪利用率，增加了养殖效益，并在一定程度上降低了某些疾病的传播风险，深受养猪企业喜欢。然而，人工授精技术的充分发展与精液是否能长期有效保存关系十分密切。猪精液冷冻保存技术可以解决猪精不能长期保存的困扰，目前公猪精液冷冻技术国内外均有研究，虽然均取得了一定突破，但操作难度大、且在受胎率、产仔数方面都低于鲜精，这也是制约冻精推广的主要因素。当前非洲猪瘟肆意传播，猪场防控形势非常严峻，引种难度加大，使用冻精引种可以多环节多层次进行病原学检测，大大降低疾病带来的风险，并且可以保存优秀公猪基因，在保种方面具有很大的优越性。1956年，Polge等首次成功进行猪精液的冷冻和保存，并利用人工授精技术获得仔猪，之后各国学者在猪精冷冻上开始了大量的研究，目前猪精冷冻方式主要分为程序冷冻和熏蒸冷冻两种，本研究通过比较两种冷冻方式对猪精的冷冻效果，以期待在保证冷冻效果的前提下利用程序冷冻仪代替传统熏蒸冷冻，来进行大规模公猪冻精批量化生产；当前猪冻精规格多数采用0.5 mL/支，虽然小规格有利于冻精生产和复苏，但在猪场实际应用较为不方便，尤其是单支解冻不利于猪场实际配种操作，目前尚未见到批量解冻冻精的报道，所以本文批量解冻实验希望能够提高冻精实际应用效率，以便更有利于冻精的推广应用。

2 材料与方法

2.1 实验动物及实验精液

沈阳秀博种猪繁育科技有限公司成年纯种公猪24头，体质健壮，性欲旺盛。原精要求：精子活力≥90%，精子密度≥2亿/mL，精子畸形率≤10%。

2.2 主要实验仪器与试剂

TurboFreezerM程序冷冻仪（米尼图），HH-6数显恒温水浴锅（常州澳华），EasyCoder2.0色带打印机（米尼图），KDC-2046低速冷冻离心机（安徽中科），冷冻精子平衡柜（米尼图），精子检测分析仪（IVOS-II，IMV），单头灌装机MPPUno（米尼图）、0.5 mL冻精细管（米尼图）、熏蒸架（田园奥瑞），自制批量解冻器。甘油（Sigma），乳化剂Equex-Paste（米尼图），基础稀释粉Androstar®CryoPlus，新鲜卵黄。

2.3 冷冻保护液配制

首先在1 000 mL的烧杯中准确倒入770 mL超纯水，在磁力搅拌器上搅拌并加热至34℃，此时缓缓倒入Androstar®CryoPlus基础稀释粉，充分搅拌溶解，待溶液pH稳定后加200 mL新鲜卵黄并充分搅拌溶解，取出500 mL作为冷却液；向剩余溶液中添加30 mL甘油和5 g乳化剂Equex-Paste，充分搅拌溶解后作为冷冻液。

2.4 精液冷冻处理

本实验主要采用熏蒸冷冻和程序冷冻来进行冻精实验，熏蒸冷冻条件为液氮面距离冻精细管横截面中心3 cm，密闭熏蒸8 min；程序冷冻采用表1的冷冻曲线进行操作。检测合格的原精使用常温保存稀释液进行1～2倍等温稀释，梯度降温至17℃，在此温度下900 g离心20 min，抽弃上清液后添加冷却液，充分悬浮后放置5℃平衡柜中平衡3 h，待精液温度降至5℃后添加冷冻液，调整精液浓度为8亿/mL，充分悬浮后进行灌装，之后分别进行熏蒸冷冻和程序冷冻。

表1 精液冷冻降温程序

2.5 解冻与检测

本实验采用50℃水浴16 s进行解冻，批量解冻实验共分为9个实验组，即单支解冻组（T1）、双支解冻组（T2），3支解冻组（T3），4支解冻组（T4），5支解冻组（T5），6支解冻组（T6），7支解冻组（T7），8支解冻组（T8），9支解冻组（T9），使用自制的批量解冻器依次解冻9个实验组冻精，每次解冻后需擦干批量解冻器，方可进行下一批次解冻，不可留有水滴，若有水滴会影响解冻效果。解冻后使用精液分析仪（IVOS-II）检测精子活力和前向精子。

3 数据统计与分析

数据先使用 Excel处理，再使用 SAS 9.2软件进行单因素方差检验，结果以“平均值±标准差“表示，P＜0.05表示差异显著。

4 结果与分析

不同冷冻方法对冻精活力和前向精子的影响，详见表2。由表2可知，熏蒸冷冻组解冻后精子活力（65.961±7.733）与程序冷冻组（70.100±8.755）差异不显著（P＞0.05）；解冻后前向精子占比两组之间也没有显著差异（P＞0.05），但程序冷冻组在数值上偏高。

表2 不同冷冻方法对冻精活力和前向精子的影响

批量解冻不同数量冻精细管，精子活力和前向精子结果如表3。由表3可知，解冻后精子活力方面，T3组精子活力（70.038±14.458）显著高于T9组（57.485±9.321）（P＜0.05），但是T3组和T9组分别与其余各组在解冻后精子活力上差异不显著（P＞0.05）；解冻后前向精子方面，T1组（36.062±11.326）、T3组（38.308±11.547）、T5组（36.600±10.204）均显著高于T9组（23.738±7.689）（P＜0.05），但与其余组之间均没有显著差异（P＞0.05），T9组与T2、T4、T6、T7、T8组之间差异不显著（P＞0.05）。

表3 0.5 mL冻精细管批量解冻后精子活力和前向精子检测结果

5 讨论

5.1 熏蒸冷冻与程序冷冻对复苏后精子活力和前向精子的影响

目前国内外精液冷冻主要采取两种方法，即熏蒸法和程序冷冻法，两种方法在不同动物上均已广泛使用。众所周知，精子在冷冻过程中面临着冰晶、渗透压及活性氧（ROS）的威胁，以一定的降温速率来冷冻精子，使其安全通过危险区对精子冷冻至关重要。研究表明，冷冻过程中水分子玻璃化状态下最有利于精子保存，对精子的理化损伤最小。熏蒸法冷冻虽然也取得了一些良好的冷冻效果，但由于其客观因素影响较大，其对降温速率主观干预性较差，而程序冷冻可以做到对冷冻曲线实时监控，人为主观调控力强，使实际降温速率最大限度地按照设定的速率进行，保证降温速率稳定进行，理论上可以增加不同批次间冷冻效果的稳定性。虽然实验1复苏后的精子活力和前向精子占比在统计学上无显著差异，但在数值上程序冷冻要优于熏蒸冷冻，目前很多学者都进行过精液不同方法的冷冻研究。熏蒸时间研究方面，如高俊锋等研究发现0.25 mL 细管在液氮面3 cm处熏蒸10 min再投入液氮获得最佳的冷冻效果；章啸君等对金华猪精液进行液氮熏蒸冷冻，也得出液氮熏蒸10 min再投入液氮有较好的冷冻效果。在冻精细管熏蒸高度研究上也有很多探索，张伟研究发现冻精细管距液氮面4 cm冷冻解冻后精子活力、运动速率和质膜完整性均达到最佳状态，而杨凯的研究结果却发现冻精细管距液氮5 cm的冷冻效果优于4 cm；周煜研究表明，冻精细管距液氮5 cm冷冻顶体完整率高于2 cm，而距液氮面9 cm熏蒸冷冻效果最差，刘莉的研究与周煜的一致，这些研究结果的差异可能是由于实验条件差异所致。Juarez等人使用程序冷冻仪进行公猪精液冷冻也取得了不错的冷冻效果。

5.2 批量解冻与单支解冻对复苏后精子活力和前向精子的影响

众所周知，冻精解冻过程中的冷冻损伤是不可避免的，如何更好地优化解冻程序，增加解冻后精子的存活率是目前冻精应用研究的方向之一。根据猪场实际需求，方便猪冻精在人工授精中的操作性，提高使用效率，特进行了0.5 mL冻精的批量解冻实验，根据实验结果，同时解冻8支0.5 mL公猪冻精与单支解冻后在精子活力和前向精子占比上均没有显著差异（P＞0.05）；当同时解冻9支时，解冻后精子活力和前向精子占比显著低于单支解冻（P＜0.05），其原因可能是由于放入水浴中的冷源过多，超过最佳升温速率的上限，无法快速通过-30℃～70℃危险区，造成精子损伤比例偏大所致。对于冻精解冻，许多学者也进行过探索，郭堂玉等研究表明，采用50℃解冻的猪冷冻精液，精子活率、质膜完整率均优于37℃和70℃解冻温度组。Roca等研究采用37℃水浴20 s解冻冻精取得了不错的效果，与Juare等人的解冻程序相同。Juare等人的研究中重点是冷冻前（17℃～5℃）精液的降温速率对冷冻效果的影响，其结果表明冷冻前精液的冷却降温速率对解冻后精子总活力没有影响。据相关报道，精子的冻融弹性因其品种品系、精子大小形状及脂质含量等特性而有所不同，所以导致冷冻和解冻程序也不尽相同。Córdova-Izquierdo等人使用不同解冻程序解冻5 mL冻精，其研究结果表明50℃水浴40 s解冻后精子的运动性高于42℃水浴40 s解冻组。本批量解冻实验与Córdova-Izquierdo的5 mL解冻实验在某种程度上可以说明解冻速率对精子复苏后的运动性影响较大，在解冻时升温速率不要超出精子承受的最大限度，在水浴温度、时间不变的情况下加入过多冷源（0.5 mL冻精细管）会影响精子复苏效率，在冷源和解冻时间相同时，降低水浴温度会影响精子复苏效果。Córdova等人研究表明，使用不同程序解冻0.5 mL和5 mL公猪冻精细管解冻后两者在精子活力上没有显著差异，但5 mL解冻后染色质稳定性显著高于0.5 mL实验组。Pei Y等的研究采用37℃水浴45 s进行解冻也取得了比较满意的效果。无独有偶，在牛冻精研究中也进行了相似的研究，使用0.25 mL和0.5 mL冻精细管进行冷冻对比，Kang等人的研究表明，0.25 mL公牛冻精解冻后快速运动精子占比（Fast progressive（%））、直线运动速率（VSL （μm/s））、平均速率（VAP （μm/s））显著高于0.5 mL细管组。Nomura等人使用不同容积冷冻管对日本鳗鱼精子进行冷冻研究，研究表明，5 mL细管冷冻日本鳗鱼精子与0.25 mL细管相比不会降低精子的运动性。研究人员在众多物种上都在进行冷冻精子的研究，解冻的程序也不尽相同，本次0.5 mL批量解冻实验可以为优化公猪冻精推广使用方案提供一定的数据支持，有利于当前环境下优秀公猪基因的传播。

6 结论

结论1：使用熏蒸冷冻（距液氮面3 cm，熏蒸8 min）和程序冷冻（使用本文降温曲线进行冷冻）公猪精液在解冻后精子活力和前向精子占比两个指标上没有显著差异。

结论2：50℃16 s水浴一次性批量解冻8支以内（含8支）0.5 mL冻精细管，解冻后精子活力和前向精子占比与单支解冻均没有显著差异，本实验对猪冻精解冻方法的研究，可为优化冻精在猪场应用提供一定的数据支撑。