猪流行性腹泻病毒灭活疫苗临床免疫效果评价

刘德琴 ，肖 敏 ，卢 昌 ，曹华斌 ，刘 建

（1.江西正邦养殖有限公司，江西 南昌 330096；2.江西正邦农业科学院，江西 南昌 330096；3.江西农业大学，江西 南昌 330045）

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea，PED） 是 由 猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起猪的腹泻、呕吐、脱水及对仔猪高致死率的一种接触性肠道传染病，猪即使耐过也会降低经济效益。20世纪80年代初PED在我国陆续发生，目前不同阶段不同品系的猪只，对此病均有高度易感性，仔猪死亡率高达80%～100%。自2010年末开始，我国猪场陆续暴发了由PEDV变异毒株引起的“顽固性腹泻”疫情，严重影响我国养猪业健康发展，给我国养猪业造成巨大经济损失。由于PED在现阶段未有特效药能够治疗，在养殖管理中，仔猪免疫防治工作尤为重要。但PEDV的S和M基因可引发较多变异，蒋新华等、德西措姆等、张月等分别对江西地区、四川地区和山东地区的PED病料测序，发现各地分离的毒株与早期疫苗株同源性较远。因此，筛选和培育出具有良好免疫原性、高毒价的毒株是疫苗研制成功的关键。本项目组近年来长期监测腹泻疫情的发生，追踪变异的PEDV毒株，以临床分离培养的变异毒株作为候选株，有针对性地开展疫苗研发，为猪流行性腹泻免疫防控提供试验基础。

1 材料

采集20个发病场病料，发病猪小肠组织经组织匀浆后，采用0.22 μm无菌过滤器（购自广州洁特生物技术有限公司），过滤后置于-20℃保存备用。试验猪场选取试验母猪80头及其所产仔猪。

2 方法

2.1 PEDV分离鉴定

将发病猪小肠组织匀浆滤液接入单层培养的Vero细胞内，加入含有胰酶的DMEM培养基，持续培养72 h，收获培养物作为种毒进行传代，收集细胞毒。经连续传代5代后，以RT-PCR法鉴定上清液中是否存在PEDV病毒。对已分离的石新某场、浛洸某场和永佳河某场毒株，扩增其S1基因序列，通过MegAlign等生物信息软件，对氨基酸同源性进化树分析。

2.2 PEDV疫苗的研制

将扩增的细胞毒通过超滤浓缩法进行浓缩，灭活后对病毒进行无菌检测，同时接种以无血清细胞悬浮培养技术和去除蛋白技术培养的Vero细胞，确定无细胞病变，灭活完全，与佐剂以体积1∶1比例均匀混合，利用生物反应器微载体细胞培养技术代替转瓶细胞培养技术，制备PEDV灭活疫苗。按《中国兽药典》和《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》要求，对疫苗进行各项检测。

2.3 免疫与攻毒保护试验

试验猪场80头母猪随机分成4组，每组20头，即商品苗组（细胞苗）、组织苗组（公司某阳性发病场小肠组织制备）、细胞苗A组（永佳河：公司湖北某场分离毒+公司广东某场分离毒）和细胞苗B组（永佳河+公司东北某场分离毒）。所有组猪只PEDV疫苗按照产前6、4、2周经后海穴注射进行免疫，其他疫苗按照猪场的常规免疫程序进行免疫，在相同的饲养管理条件下进行。母乳饲养5 d后，每头仔猪口服攻毒（永佳河），剂量为10-7.0TCID50/0.1 mL、每头仔猪口服2 mL。攻毒后观察7 d，记录试验仔猪发病（呕吐、水样腹泻）及死亡情况，采集腹泻仔猪粪便，进行PEDV抗原RT-PCR检测。攻毒试验分组情况见表1。

表1 PEDV疫苗免疫保护攻毒试验分组方案

3 结果与分析

3.1 PEDV分离鉴定

经鉴定，永佳河某场、广东某场、东北某场的病料检测结果、传代鉴定均为阳性，且在分离后出现典型病变。根据测序结果表明：广东某场（hanguang-2016）、东北某场（Shixin-2017）和永佳河某场（Yongjiahe-2015）与国内外流行毒株聚在一簇，都是变异毒株，3个毒株分别落在不同分支上，并且相互之间的氨基酸同源性低于98%，变异明显。其分属不同片区，所以认为不同片区所流行的毒株存在差异。永佳河某场分离毒株序列接近目前国内流行毒株，因此构建广东某场+永佳河和东北某场+永佳河的二价疫苗组合（见图1、图2）。

图1 广东某场、东北某场和永佳河S1基因氨基酸同源性比较

图2 广东某场、东北某场和永佳河S1基因氨基酸进化分析结果

3.2 PEDV疫苗的研制

利用生物反应器微载体细胞培养技术代替转瓶细胞培养技术制备的PEDV灭活疫苗成品，抗原滴度可到达10-7TCID50/0.1 mL。灭活疫苗无菌检验、外源病毒检验等各项质量检验均符合相关标准。

3.3 动物试验结果

3.3.1 母猪排毒量

母猪再感染后第2天出现排毒现象（见图3），第4天后组织苗和细胞苗B组排毒量较高，直至无检出。

图3 母猪再感染排毒情况

3.3.2 母猪初乳中SIgA抗体效价

四组疫苗免疫后母猪抗体都呈阳性，商品苗抗体水平基本稳定，组织苗第3天抗体水平显著上升（P＜0.05），细胞苗A组和细胞苗B组抗体水平持续较高（见图4）。

图4 免疫母猪初乳中SIgA抗体检测结果

3.3.3 临床观察

攻毒后连续观察194 h，仔猪出现腹泻判断为发病。细胞苗B组腹泻持续时间最短为132 h。攻毒后商品苗组首先出现死亡，死亡率12.5%，组织苗组死亡率2.5%，细胞苗A组死亡率0，细胞苗B组死亡率10%（见图5、图6、图7）。

图5 免疫母猪所产仔猪的发病率

图6 仔猪腹泻死亡率

图7 仔猪攻毒后腹泻指数

3.3.4 仔猪排毒量

商品苗排毒时间较长，排毒量偏高；细胞苗A组和细胞苗B组排毒持续时间较短，排毒量较少（见图8）。

图8 仔猪排毒情况

4 讨论与结论

PED的防治始于组织灭活苗，但其保护率较差且难以控制，逐渐被淘汰。马思奇等使用PEDV的CV777制备的细胞灭活苗使仔猪获得较好的免疫保护率。虽然PEDV只有一个血清型，但我们通过对各地分离的毒株进行基因序列测定，证明很多都是变异毒株，与传统毒株基因差异较大。PEDV毒株的基因变异应该是造成免疫失败和仔猪死亡率高的主要原因。

本项目利用无血清细胞悬浮培养技术和去除蛋白技术、生物反应器微载体细胞培养技术代替转瓶细胞培养技术及先进的片状载体培养工艺进行PEDV细胞灭活苗的制备，解决了生产效率低、产品质量不稳定、病毒效价低的问题。通过生产技术和生产工艺的改变，提高病毒单位培养效价10～30倍。疫苗的免疫原性、抗原含量等指标都达到国内商品疫苗的水平，抗原含量≥10-7.5TCID50/0.1 mL，高于同类产品。SIgA抗体的水平和均匀度明显高于国内水平，正如白翠认为的仔猪主要通过初乳及奶液获得母源SIgA。免疫保护试验证明本项目疫苗对仔猪具有较好的免疫保护率。检测产后母猪血清及初乳中的抗体的保护效价水平，本试验灭活疫苗保护率明显高于其他组，确定该灭活疫苗具有高特异性保护能力。

综上所述，本项目研发的猪流行性腹泻细胞灭活苗应用于不同片区猪场分离的变异毒株，具有滴度稳定和均一、易纯化等特点，获得比市场疫苗较好的免疫保护效果，能有效减少仔猪死亡率和提高母猪初乳的抗体水平。