丙泊酚对二氧化碳气腹大鼠肝功能及HMGB1/TLR4信号通路的影响

艾 玲， 徐 卉， 陈 昊

(华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科， 湖北 武汉 430030)

腹腔镜手术因其创伤小、操作精细、恢复快等特点而为外科手术的革新指明了方向，并得到广泛的应用，但腹腔镜手术中所需的二氧化碳气腹会对患者肝肾功能产生影响，目前研究发现，气腹引起的腹内压升高、肝血流改变是造成肝损伤及肝功能改变的主要原因[1]。近来研究发现，多种原因所致肝损伤均可引起高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein box 1，HMGB1)大量释放，并介导Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路释放炎症因子，在多种肝脏疾病中发挥重要作用[2]。然而在气腹引起的肝损伤过程中，HMGB1/TLR4通路的调控作用研究较少。丙泊酚可用于全身麻醉的诱导和维持，近来有文献报道丙泊酚不仅可改善肝脏缺血再灌注损伤[3]，还可在腹腔镜直肠癌根治术中降低患者血清炎症因子水平，发挥抗炎作用[4]。但丙泊酚对气腹所致肝脏损伤的改善作用未见报导。基于丙泊酚对肝脏的保护作用及在腹腔镜手术中的抗炎作用，本研究推测丙泊酚可能对气腹引起的肝损伤有缓解效果，并建立大鼠气腹模型对此进行验证，以期阐明丙泊酚发挥肝损伤保护的可能机制。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1动物:60只6～7周龄清洁级SD雄性大鼠，体重200～220g，由华中科技大学实验动物中心提供[生产许可证号为SCXK(鄂)2019-0002]，大鼠在温度23～26℃，湿度45～55%的环境中饲养。本实验经医院伦理委员会批准同意。

1.1.2主要药品、试剂及仪器:丙泊酚注射液(批号20210109，规格200mg，西安力邦制药有限公司)；联苯双酯片(批号20201229，规格25mg，北京太洋药业股份有限公司)；大鼠天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(批号MM-21301R1、MM-3057R，武汉益普生物科技有限公司)；白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(批号DM-M57136、DM-M71138，上海笃玛生物科技有限公司)；蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒(批号P0027、CL-80064，上海碧云天公司)；HMGB1、TLR4、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、干扰素-γ(IFN-γ)、β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(批号ab18256、ab217274、ab7202、ab171081、ab53013、ab10357，美国abcam公司)；羊抗兔二抗(批号AT01C9，深圳市安提生物科技有限公司)等；全自动气腹机(型号F25，武汉国惠医疗设备有限公司)；酶标仪(型号MB16-414，上海胜卫电子科技有限公司)；光学显微镜、全自动化学发光仪(型号SMZ745、CC600，上海寰熙医疗器材有限公司)等。

1.2方 法

1.2.1模型建立及分组给药:3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，参照文献[5]方法将气腹针插入腹腔内1cm，连接气腹机，加压力为20mmHg的二氧化碳，持续时间2h，建立气腹模型。待大鼠苏醒后，取大鼠腹主动脉血，用ELISA检测大鼠血清肝功能指标AST、ALT水平(高于手术前2～3倍)，视为造模成功(共50只)，随机分为气腹组、丙泊酚低、中、高剂量组、阳性对照组，每组10只。另取10只健康大鼠除不建立气腹外，其余操作同上，作为假手术组。各组均于术后2h开始给药，丙泊酚参照文献[6]设置低、中、高剂量(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)，用生理盐水稀释成浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的溶液，按10mL/kg剂量经腹腔注射给药；阳性对照组参照文献[7]设置剂量灌胃给予25mg/kg的联苯双酯溶液(生理盐水稀释成2.5mg/mL的溶液，10mL/kg剂量灌胃给药)；假手术组与气腹组经腹腔注射等量生理盐水；给药10h后取材，进行后续试验。

1.2.2肝功能检测:给药10h后，麻醉取大鼠腹主动脉血5mL，离心取上清液，检测血清AST、ALT水平。

1.2.3肝组织病理学观察:颈脱臼处死大鼠，摘取大鼠肝脏，取部分肝脏置于-80℃保存备用；剩余部分肝脏于4%多聚甲醛中固定24h，制成厚为5μm的石蜡切片，取部分切片，行苏木精-伊红(HE)染色，于光镜下观察肝脏病理变化。

1.2.4ELISA法检测肝组织IL-6、TNF-α水平:取-80℃保存的肝脏组织，解冻、匀浆、离心后取上清液，按ELISA试剂盒说明书检测炎症因子指标IL-6、TNF-α水平。

1.2.5蛋白免疫印迹法检测肝组织HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表达:取冰冻肝脏组织匀浆液，提取蛋白，BCA法测蛋白总浓度，取100μg蛋白行电泳及转膜，滴加1∶1000的一抗(HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ)抗体及1∶2000的β-actin内参抗体4℃孵育24h，加入1∶2000的羊抗兔二抗室温孵育1h，增强化学发光法显色，Image-J软件分析条带相对表达。

2 结 果

2.1各组大鼠给药后血清肝功能指标AST、ALT检测结果:与假手术组相比，气腹组大鼠血清AST、ALT水平升高(P<0.05)；与气腹组相比，丙泊酚各剂量组及阳性对照组大鼠血清AST、ALT水平降低(P<0.05)，且血清AST、ALT水平随丙泊酚剂量增加依次降低(P<0.05)；与丙泊酚高剂量组相比，阳性对照组大鼠血清AST、ALT水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清AST ALT水平比较±s，n=10)

2.2各组大鼠肝组织HE染色结果:假手术组大鼠肝组织结构完整，未见明显损伤；气腹组大鼠可见肝小叶结构紊乱，肝细胞炎性浸润及片状坏死现象明显；丙泊酚各剂量组大鼠肝细胞肿胀、变性、坏死等病理损伤程度依次减轻。见图1。

图1 HE染色检测大鼠肝组织病理损伤(×400)

2.3各组大鼠肝组织IL-6、TNF-α水平检测结果:与假手术组相比，气腹组大鼠肝组织IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；与气腹组相比，丙泊酚各剂量组及阳性对照组大鼠肝组织IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，且肝组织IL-6、TNF-α水平随丙泊酚剂量增加依次降低(P<0.05)；与丙泊酚高剂量组相比，阳性对照组大鼠肝组织IL-6、TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肝组织IL-6 TNF-α水平比较±s，n=10)

2.4各组大鼠肝组织HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表达结果:与假手术组相比，气腹组大鼠肝组织HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表达升高(P<0.05)；与气腹组相比，丙泊酚各剂量组及阳性对照组大鼠肝组织HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表达降低(P<0.05)，且肝组织HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表达随丙泊酚剂量增加依次降低(P<0.05)；与丙泊酚高剂量组相比，阳性对照组大鼠肝组织HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表3。

图2 各组大鼠肝组织HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白印迹图注A：假手术组；B：气腹组；C：丙泊酚低剂量组；D：丙泊酚中剂量组；E：丙泊酚高剂量组；F：阳性对照组

表3 各组大鼠肝组织HMGB1 TLR4 MCP-1 ICAM-1 IFN-γ蛋白相对表达水平比较±s，n=10)

3 讨 论

随着腹腔镜手术在外科诊断和治疗中的应用，其手术中气腹所致脏器损伤逐渐成为急需解决的问题[8]。邹海波等[5]研究发现气腹压力20mmHg持续1h后，解除气腹压力可导致肝脏缺血灌注再损伤及肝功能指标ALT、AST水平高于正常值2倍以上，表明给予大鼠气腹压力持续一定时间可建立肝脏损伤模型。本研究给予大鼠气腹压力20mmHg持续2h建立气腹模型，给药10h后，气腹组大鼠血清ALT、AST水平高于假手术组大鼠6倍以上，且HE染色可见肝细胞大量坏死和变性，提示气腹模型大鼠肝组织及功能受损，表明造模成功。

目前，维持最低限度气腹压力、使用氯胺酮等麻醉药物是减少腹腔镜手术中气腹对肝损伤的主要措施，虽能在一定程度上预防气腹引起的肝损伤，但特异性及防治效果欠佳[9]。丙泊酚是一种全身麻醉药，可应用于多种手术的麻醉和镇静，另外，有文献[10]报道丙泊酚可有效缓解肝脏损伤。故本研究推测丙泊酚可能对气腹引起的肝损伤有一定保护作用，并建立气腹肝损伤大鼠模型对此进行验证，发现给予气腹肝损伤大鼠丙泊酚低、中、高剂量及阳性药物治疗后，丙泊酚低、中、高剂量组及阳性对照组大鼠肝组织细胞坏死和变性现象明显缓解，血清ALT、AST水平均显著低于气腹组大鼠，提示丙泊酚可改善气腹肝损伤大鼠肝功能及病理损伤。

HMGB1含量对肝损伤诊断及预后有重要的诊断及预测作用[11]。袁苏榆等[12]研究发现，对过量乙酰氨基酚所致急性肝功能衰竭患者血清HMGB1水平迅速升高，且早于ALT等肝功能指标变化，表明HMGB1水平更能及时灵敏地诊断出药物所致肝损伤。HMGB1不仅可由坏死细胞被动释放，还可由活化的单核、巨噬等免疫细胞释放，通过与TLR4受体结合将其激活，活化的TLR4可诱导炎性细胞因子和趋化因子聚集，促进肝脏发生炎性损伤和纤维化，导致肝功能衰竭[13]；还可刺激IFN-γ表达进一步促进HMGB1的释放[14]。另外活化单核细胞产生的IL-6、TNF-α也可诱导MCP-1、ICAM-1等多种趋化分子及粘附分子表达释放，促进血管内皮细胞粘附，进而加重组织损伤[15]。本研究发现，气腹组大鼠肝组织中HMGB1、TLR4、IFN-γ、MCP-1、ICAM-1蛋白及IL-6、TNF-α水平均明显高于假手术组，提示气腹肝损伤大鼠肝组织中HMGB1/TLR4通路处于活化状态，推测HMGB1/TLR4通路活化诱导炎性细胞因子和趋化因子聚集，可能是气腹导致肝脏损伤的主要病理机制。而丙泊酚各剂量组及阳性对照组肝组织HMGB1、TLR4、IFN-γ、MCP-1、ICAM-1蛋白及IL-6、TNF-α水平均明显低于气腹组，提示丙泊酚及阳性药物治疗后，HMGB1/TLR4通路活化程度较低，炎性因子水平较低，表明丙泊酚降低气腹大鼠肝脏损伤的作用可能与抑制HMGB1/TLR4通路有关。

综上所述，丙泊酚可抑制HMGB1/TLR4通路激活，降低肝组织炎症因子及趋化因子表达，缓解气腹大鼠肝脏损伤，可能为丙泊酚在腹腔镜手术中应用提供一定参考。但腹腔手术中气腹引起肝损伤的分子机制较为复杂，HMGB1/TLR4信号转导通路的下游靶基因较多，丙泊酚也可能通过其他途径改善腹腔手术中气腹引起的肝损伤，有待后续进一步验证。