超声处理对哈萨克羊肉品质的影响

张莉，孙佳宁，朱明睿，邢世均，刘广娟，肖志远，姜美龄，王子荣

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830000）

哈萨克羊属“肉脂兼用”型，在新疆存栏数量占比最大[1]。该品种羊常年放牧，适应能力较强，具有四肢健壮，肌肉发达的特点。但由于其生产周期长，导致肉硬度大，口感较差[2]，消费者的接受度低。肉品嫩度不仅与自身品种有关，还与宰后成熟程度有关。动物经屠宰死亡后，生命活动也随之停止，糖酵解过程进入无氧呼吸阶段，肌肉开始僵直，此时肉的硬度大、保水性差、加工性能低。随着成熟时间的延长，胴体在解僵的作用下硬度降低，嫩度增加，系水力和风味均有所增加，从肌肉转变为可食用肉。研究表明，宰后充分成熟对肉的色泽、嫩度及保水性等有明显改善[3,4]，通过延长成熟期可以提高肉的食用品质[5]。因此了解原料肉在僵直-成熟过程中的品质变化，对肉制品加工企业有重要意义。

超声波是指频率在20~100 kHz、强度>1 W/cm2的物理加工技术，具有效率高、操作简单、污染小及安全性高的优点，广泛应用在肉制品加工[6]。超声波产生的空化、机械及热效应不仅可以改变肉制品的蛋白结构[7,8]，还可以破坏肌肉细胞的完整性、促进酶促反应作用于肉类组织。该技术能够有效改善肉品嫩度，缩短肉品所需成熟时间，减少资源浪费。李兰会等[9]发现超声波水浴处理，能明显提高山羊肉块的嫩度，使山羊肉提前3 d成熟。朱琪等[10]利用超声波处理羊背最长肌，发现超声波处理降低了欧拉藏羊肉的剪切力值、硬度值，提高了欧拉藏羊肉的蛋白溶解性、MFI，认为超声处理能够较大程度改善肌肉品质。

目前超声波对羊肉嫩度影响效果研究较少，因此本研究以哈萨克羊半膜肌为试验对象，分别超声处理0、20、40 min后置于4 ℃冰箱进行冷藏成熟，以pH值、ATP含量、色差、蒸煮损失、剪切力、MFI及MP溶解度、浊度等指标为评判标准，研究超声对羊肉嫩度及品质的影响，为预测和控制宰后肌肉嫩化的速度和程度提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

哈萨克羊（14月龄），新疆乌鲁木齐市米东区新华凌市场；KH2PO4，分析纯，云诚化工有限公司；K2HPO4，分析纯，廊坊天科生物科技有限公司；KCl，分析纯，山东凯米科化工股份有限公司；牛血清白蛋白，北京索莱宝科技有限公司；ATP含量测定试剂盒、总蛋白定量测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。其余试剂均为分析纯。

KQ250DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HR40-IIA2生物安全柜，青岛海尔特种电器有限公司；FSH-2A可调高速匀浆机，常州天瑞仪器有限公司；SF-GL-16A高速冷冻离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；T6新世纪紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料处理

哈萨克羊（6只未去势的14月龄公羊、质量约50 kg），宰前24 h禁食禁水，屠宰放血30 min内取出半膜肌，剔除肌肉表面脂肪、筋膜及结缔组织，装入标记好的自封袋，置于冰盒内（0~4 ℃）2 h内运回实验室。

1.2.2 试验设计

将半膜肌沿肌纤维方向分割成200±5 g的肉块，分别置于标记好的真空包装袋内，浸于超声波清洗器内，设置超声频率：40 kHz，功率：100 W，超声时间：20 min、40 min，温度：20 ℃左右，对照组采用直接冷藏处理。所有处理组均设置3个平行，于4 ℃冰箱冷藏0、2、12、24、72、120、168 h后测定相关指标[10]。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 pH值

参照郭守立等[11]的方法，将TESTO 205便携式pH计的探头插入肉样2 cm左右，测定其pH值，待读数稳定，记录结果并取平均值，每个样品随机取6个点进行测试。

1.3.2 ATP含量

参照李桂霞等[12]的方法，采用ATP含量测试盒测定。利用天平准确称取1.0 g肉样，加入9 mL煮沸的双蒸水，调整高速匀浆机转速为11000 r/min，冰浴条件下匀浆3次，每次30 s（中间间隔60 s），制成10%的匀浆液，置于10 mL离心管内，并在沸水中煮10 min，取出后混匀抽提1 min，设置离心机参数，转速：3500 r/min、时间：10 min，取上清液待用。用双蒸水将上清液浓度调整为0.5%，总蛋白定量测定试剂盒测定蛋白浓度，以每克蛋白含有ATP的物质的量作为ATP含量单位。

1.3.3 色差

参照郭守立等[11]的方法，将肉样取出后用吸水纸擦干其表面的水分并置于试验台表面，同时对色差仪进行校准，校准完毕测定样品的亮度值（L*值）、红绿值（a*值）及蓝黄值（b*值），每个样品随机选取6个点进行测定，结果取平均值。

1.3.4 蒸煮损失

参考Gambuteanu等[13]的方法，并在其基础上进行优化。沿肌肉纤维方向，将肉样切成5 cm×3 cm×2 cm肉条，用吸水纸将其表面水分擦干称重，记为m1并置于蒸煮袋内，将蒸煮袋置于85 ℃水浴锅中加热，当肉样中心温度为70±1 ℃，立即取出，并将样品流出汁液进行擦拭，冷却至室温后对肉条称重，记为m2，称重后的肉样用于剪切力测定，蒸煮损失按照下列公式进行计算。

1.3.5 剪切力

参照李桂霞等[12]的方法。沿肌纤维方向用取样器取直径为1 cm的肉柱，利用肌肉嫩度仪下测定剪切力。1.3.6 MFI

参考Culler等[14]的方法，利用天平准确称取1.0 g肉样，切碎后加入10 mL预冷的MFI缓冲液（100 mmol/L KCl、11.2 mmol/L KH2PO4、8.8 mmol/L K2HPO4、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3），按照1.3.2的方法制备组织匀浆液，再将匀浆液置于高速冷冻离心机中，设置参数为转速：2500 r/min、温度：4 ℃、时间：20 min，去除上清液，此过程重复两次，得到MP沉淀。再加入5.0 mL预冷的MFI缓冲液将沉淀充分悬浮，用200目筛网过滤悬浮液去除结缔组织，利用双缩脲法测定滤液的蛋白浓度，最后用MFI缓冲液将蛋白浓度调整为0.50±0.05 mg/mL，540 nm波长处测定紫外吸光度A，结果乘200得到MFI。

1.3.7 MP溶解度、浊度

1.3.7.1 MP提取

参考Park等[15]的方法，利用天平准确称取1.0 g肉样，加入10 mL预冷的920 mmol/L的磷酸钾缓冲液（0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、2 mmol/L EDTA pH 6.8），按照1.3.2的方法制备组织匀浆液，将匀浆液置于高速冷冻离心机中，设置参数转速：2500 r/min、温度：4 ℃、时间：20 min，弃上清液，此过程重复两次，得到MP沉淀，将沉淀与4 mL 0.1 mol/L氯化钠溶液充分悬浮，将悬浮液置于高速冷冻离心机内，设置参数转速：2500 r/min、温度：4 ℃、时间：20 min，弃上清液，此过程重复两次，得到纯化MP沉淀。

1.3.7.2 MP溶解度

参照Zhang等[16]的方法，并稍做优化。向MP沉淀内加入1.3.7.1中的磷酸缓冲液使浓度调整为2.0 mg/mL，取5 mL加入10 mL离心管内，设置高速冷冻离心机参数转速：10000 r/min、温度：4 ℃、时间：20 min，双缩脲法测定上清液蛋白质浓度。

1.3.7.3 MP浊度

参照Li等[17]的方法，向MP沉淀中加入1.3.7.1中的磷酸缓冲液使调整浓度为1.0 mg/mL，在660 nm处测定紫外吸光值，磷酸盐缓冲液做空白对照，每个样品测定3次，结果取平均值。

1.4 数据处理

数据采用Microsoft Excel 2016整理、作图，运用SPSS 19.0软件（SPSS公司）（Duncan法）分析数据差异性，结果以（平均值±标准差）表示。

2 结果与讨论

2.1 超声处理对羊半膜肌pH值的影响

pH值反映肌肉乳酸、无机磷酸的沉积量，间接反映糖酵解程度。超声处理羊半膜肌的pH值变化情况如图1所示。随成熟时间的延长，肌肉pH值呈先下降后缓慢上升趋势。超声处理组的pH值较直接冷藏组下降速度缓慢，且提前到达最低点，12 h后大于直接冷藏组（p<0.05）；超声处理组在72 h后pH值变化不显著（p>0.05），直接冷藏组在120 h后到达最小值（5.39）后小幅度上升。

机体宰后呼吸停止，糖酵解进入无氧呼吸阶段，糖原分解产生乳酸导致机体pH值下降[18]，而后缓慢上升可能是微生物的繁殖作用或蛋白质发生降解产生含氮化合物[19]。研究表明该技术可以延缓肉品pH值降低，高pH值肉的钙蛋白酶活性高、蛋白降解速度快且嫩度高[20]。Got等[21]用超声波（2.6 MHz，10 W/cm2）处理牛的半膜肌发现，初始pH值高的肉，嫩度较高；Jayasooriya等[22]用超声波（24 kHz，12 W/cm2）处理发现其pH值降低缓慢，剪切力显著降低，与本研究结果一致。可能是由超声产生的空穴效应引起，空穴效应能使蛋白水解酶、脱氨基酶释放，提高碱性胺类的利用率[23,24]，而酸性蛋白基团的数量降低[25]，另外超声能够促进某些离子从细胞内释放到细胞外，导致某些离子基团位置发生改变[26]，最终导致pH值升高。

2.2 超声处理对羊半膜肌ATP含量的影响

ATP是直接供给肌肉代谢的能源物质。不同处理下肌肉的ATP含量变化情况如图2所示。随着成熟时间的延长，各处理间均呈先上升后下降趋势，超声处理组显著低于直接冷藏组（p<0.05）。半膜肌超声20 min、超声40 min组分别在12、2 h后开始下降，72 h后下降不明显，说明成熟完全，直接冷藏组在24 h后始终处于下降趋势。上述结果表明，超声处理可以使肌肉提前进入僵直期，并加快成熟进程。

宰后羊呼吸停止，但机体的功能活动仍在继续，为维持能量平衡，骨骼肌内的酶在无氧条件下进行糖代谢合成ATP，产生乳酸[27]，随着肌肉内ATP的消耗殆尽，引发肌质网的钙泵功能奔溃，钙离子被释放但不能回收，随着肌浆钙离子浓度的增大，肌肉嫩度降低，进入僵直状态；另外ATP含量降低促进腺苷酸活化蛋白激酶[Adenoisune5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]活化，它的活化会增加机体对葡萄糖的摄取，抑制糖原合成代谢，加快糖酵解进程，引起pH值发生变化，最终影响肌肉成熟速度[28-30]，此外，Nakashima等[31]表明AMPK的激活刺激了骨骼肌中MP的降解，也对肉品嫩度有积极作用。本试验发现超声处理能够较大程度降低肌肉内ATP含量，进一步验证了超声处理可以降低肌肉硬度，提升肉品嫩度。

2.3 超声处理对羊半膜肌色差的影响

肉的色泽直接影响消费者的购买欲望，它是人们判断肉品新鲜度的重要指标[32]。超声处理后羊半膜肌的色差变化情况如表1所示。随着成熟时间的延长，超声处理后肌肉L*值均显著高于直接冷藏组（p<0.05），而a*值低于同期直接冷藏组（p<0.05）。超声处理产生空化效应和机械效应，空化泡破裂产生局部的瞬时高温、高压[33]，使肌纤维结构遭到破坏，自由水含量上升，L*值升高，肉色更加鲜亮；但超声处理降低了羊肉的a*值，分析认为是氧合肌红蛋白（MbO2）被氧化生成褐色的高铁肌红蛋白（Metmyoglobin，MetMb），且肌红蛋白变性，使其a*值降低[34]；b*值变化趋势不显著（p>0.05），这与陈丽艳等[35]研究结果一致，可能与超声功率和超声时间有关。

表1 不同超声时间对羊半膜肌亮度值（L*）、红绿值（a*）、黄蓝值（b*）的影响Table 1 The influence of different ultrasound time on the brightness value (L*), red-green value (a*), blue-yellow value (b*) of the semimembranosus in sheep

2.4 超声处理对羊半膜肌蒸煮损失的影响

蒸煮损失反映肉的保水性，超声处理后羊半膜肌的蒸煮损失变化情况如图3所示。不同处理下半膜肌的蒸煮损失变化趋势相同，0~24 h逐渐上升至最大值，此时超声40 min（35.67%）>直接冷藏（34.74%）>超声20 min（33.83%）；24~168 h超声处理组显著低于直接冷藏组（p<0.05），第168 h时，超声20 min与超声40 min分别降低了3.28%、2.78%，说明超声处理能够在一定程度上提高肉的保水性。

超声强度、时间能够直接影响肉品持水性。Zou等[36]发现当超声强度高于93.33 W/cm2时，经腌制后的牛肉蒸煮损失逐渐增加；Zhang等[16]发现当超声强度低于150 W/cm2时，MP凝胶结构均匀致密且保水性较高，但高于150 W/cm2时，凝胶内部出现孔洞，且随着超声强度加大，保水性显著降低。Li等[37]研究不同超声时间（10、20、30、40 min）对鸡胸肉蛋白功能特性的影响，表明10 min或20 min均能提高其持水能力，改善肌肉质构，但40 min时，产品持水能力显著降低，失水率增加。

2.5 超声处理对羊半膜肌剪切力的影响

剪切力是评价肉嫩度的重要指标，剪切力越大，嫩度越差[38]。超声处理后肌肉的剪切力变化情况如图4所示。随着成熟时间的延长，肌肉各处理组均呈下降趋势，超声处理组显著低于直接冷藏组（p<0.05），12~24 h时，各处理组缓慢上升，表明肌肉进入僵直前期。超声处理组在24~168 h显著下降至最小值（超声20 min为37.54 N，超声40 min为41.37 N）（p<0.05），而直接冷藏组缓慢下降至最小值（50.42 N）。上述结果表明超声处理使得肌肉提前进入僵直期，并且对肉的嫩化起积极作用。

嫩度的大小是各种生物化学物质相互作用的结果，受肌肉纤维收缩、胶原蛋白、结缔组织含量及pH值的影响[39,40]。超声产生热效应、空化效应及机械效应能破坏肌肉结缔组织、MP和溶酶体等，使钙蛋白酶、组织蛋白酶及Ca2+等固体物质提前释放并进入细胞间隙，肌肉提前僵直；随着成熟时间的延长，肌纤维拉伸，肌节长度增加，实现肌肉嫩化[41,42]。

2.6 超声处理对羊半膜肌MFI的影响

MFI用于预测宰后肌肉的嫩度大小，MFI值越大，MP降解程度越大，嫩度越高[43,44]。超声处理后肌肉的MFI变化情况如图5所示。随着成熟时间的延长，半膜肌不同处理间差异显著，超声处理组均显著大于直接冷藏组（p<0.05），超声处理组在2~24 h缓慢下降，进入僵直期，在24 h时达到最小值（超声20 min为32.20，超声40 min为37.60）后呈上升趋势；直接冷藏组在2~72 h始终呈下降趋势，72 h时达到最小值（25.92）后呈上升趋势。Wang等[45]发现，超声处理（20 kHz、25 W/cm2）提高了肉品的MFI，增加了嫩度。Yeung等[46]利用超声处理猪腰肉发现，超声后的MFI显著提高，嫩度得到很大程度的改善，与本研究结果一致。

2.7 超声处理对羊半膜肌MP溶解度的影响

蛋白溶解度是溶液中的蛋白质量占肌肉总蛋白质量的比，它反映蛋白质与水之间的平衡与相互作用，与肌肉的持水性相关[47]。超声处理后肌肉的MP溶解度变化情况如图6所示。肌肉的溶解度随着成熟时间的延长呈波动上升趋势，超声处理组均显著大于直接冷藏组（p<0.05）。超声处理组及直接冷藏组分别在24 h、72 h达到最小值（超声20 min为11.90%、超声40 min为17.71%，直接冷藏为5.20%）后逐渐上升。这与Hasnain等[48]研究结果一致。超声波空化效应产生局部高温高压，导致蛋白小聚体破碎、分子结构变得疏松，疏水性氨基酸释放，使更多的亲水基团暴露到蛋白质的表面，增加蛋白质与水的相互作用[49]，导致MP溶解度的增加。

2.8 超声处理对羊半膜肌MP浊度的影响

浊度用于评估MP分散体的聚集水平[50]，浊度越高，说明蛋白质聚集程度越高，溶液中悬浮颗粒粒径越大，反之亦然。超声处理后肌肉的浊度变化如图7所示。随着成熟时间的延长，各处理组均呈波动下降趋势，且超声处理组始终低于直接冷藏组（p<0.05）。超声处理组及直接冷藏组分别在12、2 h后开始上升，在24、72 h后开始下降；超声产生的空化效应使氢键断裂，疏水相互作用遭到破坏，进而导致蛋白聚集体破碎、可溶性蛋白结构遭到破坏，减小了蛋白质的粒径，降低了样品的浊度，与溶解度结果对应。

3 结论

动物宰后呼吸停止、供氧中断，为维持稳态，机体进入无氧酵解，该过程产生能量物质，但随着糖原的消耗殆尽，ATP含量降低，并积累了大量乳酸，导致肌肉的pH值迅速下降，肌肉进入僵直阶段，此时肌肉嫩度较差；随着肌肉解僵，肌肉剪切力下降，促进MP聚合和降解程度高，MP溶解度增加。本试验中超声处理能够显著提高肌肉的pH值、L*值、MFI及MP溶解度，降低肌肉ATP含量蒸煮损失及剪切力，进而改善肉品保水性与嫩度，缩短肌肉成熟所需时间。与超声20 min相比，超声40 min的蒸煮损失较大，且能耗较大，因此认为超声时间控制在20 min左右较好。