基于网络药理学和分子对接分析豆根管食通口服液治疗食管癌的分子机制*

邝玉慧，陈欣菊，徐方飚，陈晓琦，郑玉玲

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000

食管癌(esophageal cancer，EC)是恶性程度较高的一类肿瘤，具有易复发和远距离转移的特性，病死率居世界恶性肿瘤第6位[1]。食管癌分为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocacinoma，EAC)两个类型，在中国，ESCC是最常见的类型[2]。EC早期发现比较困难，通常发现时已是晚期。目前，治疗EC以手术、放疗、化疗、靶向治疗、热疗等多学科诊疗模式(multiple disciplinary team，MDT)为核心，但由于EC较易发生肿瘤的浸润、转移和复发，其五年的生存期仍然低于25%[3]。中医认为，“痰瘀互结”是EC重要的病因病机。郑玉玲教授同样重点强调“痰”和“瘀”在食管癌发生发展中的作用，认为食管癌的发病机制多以正气亏虚为本，痰气瘀毒为标，尤以痰瘀为主，证属本虚标实[4]。研究表明，中医药配合放化疗有增敏减毒的作用，可提高患者生活质量，其机制可能为增强机体免疫功能、诱导癌细胞凋亡、调节肿瘤微环境[3，5-6]。

郑玉玲教授在多年食管癌治疗的基础上，拟定以“化痰祛瘀”为治则，具有化痰理气、活瘀散结、止痛抗癌的中药复方——豆根管食通口服液。豆根管食通口服液由山豆根、沉香、黄药子、急性子、制天南星、姜半夏、三七、郁金等8味中药口服液组成。山豆根为君药，具有散结消肿、清热解毒、利咽的功效；制天南星温化顽痰，黄药子解毒散结消瘀，急性子软坚消瘀，姜半夏化痰散结降逆，沉香降逆行气，郁金止痛活血，共为臣药；三七化瘀理气为佐使药。上述诸药合用，共奏解毒散结、化痰祛瘀之功，适用于痰气交阻、瘀血内结及痰瘀互结等证型的食管癌患者。豆根管食通口服液可降低患者血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)及血清肿瘤标志物唾液酸(sialic acid，SA)的水平，明显提高患者血清干扰素-γ(interferon-γ，INF-γ)和血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、IgG、IgM的水平，提高患者免疫功能，缩小或稳定肿瘤病灶，提高患者生活质量，延长患者生存期，改善患者预后[7-9]；抑制Eca-109细胞的增殖，促进Eca-109细胞凋亡及食管癌模型大鼠的癌细胞凋亡[10-12]。

目前，豆根管食通口服液治疗EC的作用机制尚未完全阐明。本研究借助网络药理学和分子对接技术，分析豆根管食通口服液治疗EC的作用机制，为临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 豆根管食通口服液活性成分的收集与筛选根据2015年版《中华人民共和国药典》规范豆根管食通口服液中8味中药的名称，采用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，检索豆根管食通口服液组方中药的化学成分，以口服生物采用度(oral bioavailability，OB)≥30%及类药性(drug likeness，DL)≥0.18为标准，对所有化学成分进行筛选，搜集活性化学成分，建立药物活性化学成分数据集。

1.2 豆根管食通口服液组成药物活性成分相关靶点搜集采用TCMSP检索豆根管食通口服液组方中药活性成分的相关靶点，使用Uniprot数据库中UniProKB(https：//www.uniprot.org/)检索功能，输入靶蛋白名称，限定物种为“Homo sapiens”，剔除非人源靶点，将查询得到的所有蛋白名称转化为基因ID，建立活性成分靶点数据库。

1.3 EC靶点搜集采用人类孟德尔遗传在线数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//omim.org/)[13]、疾病关联数据库(genetic association database，GAD，https：//geneticassociationdb.nih.gov/)、人类基因数据库(the human gene database，GeneCards，https：//www.genecards.org/，v4.12.0 Build 31)[14]，限制物种为“homo sapiens”，以“esophageal cancer”为关键词进行检索，搜集与EC相关的靶点，建立数据库。

1.4 “药物-疾病”交集靶点筛选及豆根管食通口服液治疗EC有效活性成分筛选将EC靶点数据库与活性成分相关靶点数据库进行映射，交集靶点即为豆根管食通口服液治疗EC的有效靶点，将有效靶点与活性分相关靶点进行比对，删除活性成分非交集靶点对应的添生成分即为豆根食通口服液治疗EC的有效活性成分。

1.5 “药物-活性成分-靶点”网络图构建将药物、有效活性成分及交集靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，并绘制“药物-有效活性成分-靶点”网络图。

1.6 豆根管食通治疗EC的关键靶点及分析STRING数据库可通过文献等数据支撑，提供蛋白质之间相互作用证据。MCC(maximal clique centrality)算法是一种基于密度的非交叠式聚类算法，以种子节点为中心进行扩展，在其邻居节点中寻找满足要求的节点[15]，能更好地预测互作网络中的关键蛋白。将豆根管食通口服液治疗EC的有效靶点导入STRING数据库进行蛋白质相互作用(protein protein interaction，PPI)分析，限制物种为“homo sapiens”。将得到PPI网络导入Cytoscape，通过关键节点分析工具Cytohubba的MCC、度(degree)、中介中心度(betweeness)及邻近中心度(closeness)4种网络拓扑分析的关键特征参数[16]，分别计算前出30个核心靶点，取相同靶点为关键靶点。

1.7 关键靶点富集分析采用DAVID数据库对关键靶点进行基因本体(gene discovery，GO)生物功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析，其中GO生物功能富集分析包含三大类，分别是生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。限定物种为“homo sapiens”，设定标准为P≤0.05，Q≤0.05，根据通路富集结果，导入Cytoscape软件进行可视化分析。

1.8 分子对接验证分子对接以受体理论为基础，通过计算机虚拟模拟，评价药物活性成分与关键靶点的结合能力。本研究采用AutoDock软件进行分子对接验证，并采用Pymol软件去除氢原子及配体，并将对接结果可视化，以此评价豆根管食通口服液有效活性化合物与靶蛋白之间的结合活性，并根据其结合能大小筛选出豆根管食通口服液治疗EC的潜在核心化合物。

2 结果

2.1 豆根管食通口服液活性成分的获取及相关作用靶点的搜集通过检索TCMSP数据库，并以OB≥30%、DL≥0.18为标准筛选得到豆根管食通口服液的活性成分97种，其中山豆根21种、沉香9种、急性子9种、黄药子15种、姜半夏13种、三七8种、制天南星7种、郁金15种。通过TCMSP数据库获取豆根管食通口服液有效活性成分相关靶点128个。见表1。

表1 豆根管食通口服液中各中药OB值前5位的活性成分信息表

2.2 豆根管食通口服液治疗EC的有效靶点及有效活性成分的筛选采用OMIM、GAD及GeneCards数据库检索并搜集与EC疾病相关靶点6 095个。将97种豆根管食通口服液活性成分的128个相关靶点与6 095个EC疾病相关靶点进行映射，得到106个相同靶点，即为豆根管食通口服液治疗EC的有效靶点。将106个豆根管食通口服液治疗EC的有效靶点与128个活性成分的相关靶点进行对比，删除22个非有效靶点对应的活性成分，即为豆根管食通口服液治疗EC的有效活性成分，共59种，其中山豆根16种、沉香9种、急性子8种、黄药子14种、姜半夏13种、三七7种、制天南星6种、郁金2种。

2.3 “药物-有效活性成分-靶点”网络构建将8味中药对应的有效活性成分及豆根管食通口服液有效活性成分治疗EC的有效靶点导入Cytoscape软件进行映射，构建“药物-有效活性成分-靶点”，见图1。

图1 豆根管食通口服液治疗EC的“药物-有效活性成分-靶点”网络

2.4 PPI网络分析结果将豆根管食通口服液有效活性成分治疗EC的有效靶点导入STRING数据库，获取PPI网络，并将PPI网络导入Cytoscape软件，通过Cytohubba插件进行4种算法分析，分别筛选出前30位靶点，并绘制4种算法Veen图，得到21个交集靶点，即为关键靶点，分别是MAPK3、IL-6、EGF、CAT、JUN、EGFR、PTGS2、AR、VEGFA、ESR1、IL-1β、PPARG、MAPK1、MAPK8、HSP90AA1、CYCS、MMP1、MTOR、IL-2、CCL2、HMOX1，见图2、图3。

图2 蛋白互作网络图

图3 Cytohubba 4种算法筛选出关键靶点的Veen图

2.5 GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析采用DAVID数据库对关键靶点进行GO生物功能和KEGG信号通路富集分析，以P≤0.05，Q≤0.05为标准筛选后得到GO生物功能条目1 476条，KEGG信号通路107条。1 476条GO生物功能包括1 314条生物学过程、59条分子功能及26条细胞组分，其中生物学过程主要涉及DNA结合转录因子活性的调节、细胞对氧化应激的反应等；分子功能主要涉及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)活性、生长因子活性等；细胞组分主要涉及囊泡腔、膜区等。107条KEGG信号通路主要涉及白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)信号通路、辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)细胞分化、缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路等。将差异显著的前20条通路导入Cytoscape软件，构建“通路-靶点”网络，靶点参与所富集的通路越多，则该靶点所代表的三角形形状越大；通路所含靶点越多则该通路所代表的菱形形状越大，见图4、图5、图6，表2。

表2 差异显著的前20名通路富集结果

图4 GO生物功能富集分析气泡图

图5 KEGG通路富集分析气泡图

图6 “通路-靶点”网络图

2.6 分子对接验证分析根据数据结果及文献支持，选取在“药物-有效活性成分-靶点”网络中度值最高的3种成分：即β-谷甾醇(β-sitosterol)、槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)，采用计算机模拟与通路中度值较高的两个关键靶点MAPK3、EGFR进行分子对接验证。成分结构来源于Pubchem数据库，靶点蛋白结构来源于PDB(protein data bank)数据库，采用Pymol去除氢原子及配体后并将对接结果可视化，导入AutoDock进行对接模拟，结合能小于-7 kcal·mol-1则认为该结合具有较高的结合能力，结合能值越低则表示结合越稳定。结果显示，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、MAPK3与3个化合物的结合能均小于-7 kcal·mol-1，说明化合物均能与EGFR、MAPK3结合。见图7，表3。

图7 分子对接结果

表3 分子对接结果

3 讨论

中医认为，人是一个整体，治疗疾病时要系统全面，从多角度、多方面出发起到缓解病症、延缓疾病进展的作用。网络药理学研究是采用整合的中药活性成分及相关靶点数据库与信息分析技术，从整体出发，系统挖掘潜在的中药治疗疾病的作用机制，与中医的整体观念相契合。本课题组采用网络药理学和分子对接技术，系统而全面地挖掘豆根管食通口服液治疗EC的潜在作用机制。

本研究筛选出豆根管食通口服液治疗EC的活性成分共59种，其中山豆根16种、沉香9种、急性子8种、黄药子14种、姜半夏13种、三七7种、制天南星6种、郁金2种。从活性成分种类数目来看，符合山豆根为君药，而制天南星、急性子、黄药子、姜半夏、郁金及沉香共为臣药的君臣关系。本研究发现，度值前3位的成分分别为槲皮素、β-谷甾醇与山柰酚，表明这3个化合物可能是豆根管食通口服液治疗食管癌的关键成分。β-谷甾醇为半夏、沉香、天南星、急性子、黄药子、三七和郁金等7味中药的活性成分，是一种植物甾醇，具有降低血脂、抗癌和抗炎的作用[17-18]。Zhu等[19]研究发现，β-谷甾醇可提高机体免疫力，并参与调节肿瘤细胞的生长和凋亡信号转导路径，从而影响肿瘤细胞的生长。槲皮素是沉香、黄药子、急性子、三七、山豆根的活性成分，是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物。研究显示，槲皮素可抑制胃癌、肝癌等多种肿瘤细胞的生长、迁移，抑制血管生成，诱导肿瘤细胞凋亡、坏死和自噬[20]。诱导癌细胞凋亡是槲皮素发挥抗癌作用的重要方式，可激活死亡受体途径或线粒体信号转导途径，诱导癌细胞凋亡[21]。此外，槲皮素亦具有增敏和减轻放化疗不良反应的作用[22]。山柰酚是急性子、黄药子、山豆根的活性成分，可通过线粒体途径抑制人食管癌Eca-109细胞的增殖，并诱导细胞凋亡[23]，在胃癌细胞中亦能抑制细胞生长并且诱导细胞凋亡[24-25]。山柰酚还可通过激活宿主免疫力，抑制肿瘤血管生长并增加其他抗癌药物的敏感性来发挥抗癌作用[26]。

本研究共筛选出豆根管食通口服液治疗EC的关键靶点21个，大致分为蛋白激酶、激素及其受体、过氧化氢酶、热激蛋白和转录因子等。MAPK是一种激活丝氨酸-苏氨酸磷酸化的蛋白激酶，在细胞增殖、生长及凋亡中发挥重要作用。目前，已经鉴定出的MAPK途径有许多，其中细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)途径中的ERK1，亦称为MAPK3，是本研究的核心靶点。研究表明，抑制ERK1即MAPK3的活性，细胞增殖将受到明显抑制[27-28]。分子对接结果显示，MAPK3与槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚均能较好地结合，提示豆根管食通口服液的有效成分可能参与调节MAPK3的表达，从而起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。

EGFR是一类属于表皮生长因子受体家族的跨膜受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)，可启动多种细胞内信号通路，促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡、侵袭、转移[29]。其中血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)是参与内皮细胞增殖、分化和迁移的促血管生成因子之一。MAPK、ERK和PI3K-Akt信号通路是将细胞外信号传递到细胞核内最重要的信号通路，在调控细胞增殖、血管生成和代谢等中发挥关键作用。研究表明，裸鼠瘤体微血管密度显著降低，VEGF表达降低，肿瘤内血管新生的形成明显抑制[30]。本课题组前期基础研究发现，豆根管食通口服液可抑制VEGF的表达[31]。分子对接结果显示，EGFR与槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚均能较好的结合，提示豆根管食通口服液的有效成分可能参与到EGFR的调节，从而达到抑制肿瘤细胞内血管新生的作用。通路富集发现，TNF通路有显著差异，而本课题组前期基础研究发现其可提高患者血清中 IL-6 与IL-10水平，提高机体免疫力[32]，其中 IL-6 本次研究的关键靶点。以此可以初步推断本次网络药理学研究是成功的，具有一定的代表性。

综上所述，豆根管食通口服液可以通过多成分、多靶点及多途径的方式发挥治疗EC的作用，为进一步探讨其治疗EC的作用机制提供了科学依据，也为中药复方抗EC的物质基础和作用机制提供了重要的科学依据。