基于网络药理学探讨四神煎治疗类风湿关节炎的作用机制*

付静思，姜泉，夏聪敏，但文超，巩勋，岳铭，唐晓颇

1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053； 2.北京中医药大学，北京 100029

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以关节疼痛、变形、功能损伤为主要临床症状的系统性自身免疫性疾病，由于其高致残率和多脏器损害而严重影响患者的身心健康[1]。目前，西医对RA的治疗以控制炎症、调节免疫功能为主，临床主要使用的药物有非甾体类抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS)、糖皮质激素、抗风湿药(disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)和生物制剂等。然而，这些药物长期应用可引起肝肾功能损害、胃肠道不适、骨质疏松等多种不良反应[2]。临床实践证实，中药复方治疗RA具有疗效确切、不良反应小的特点。四神煎作为调治气阴两虚型RA的常用方[3]，有益气养阴、祛风通络、清热解毒之功效，其最早记录于清·鲍相墩《验方新编·两膝疼痛》，全方由生黄芪(半斤)、远志(三两)、牛膝(三两)、石斛(四两)、金银花(二两)组成，用以治疗鹤膝风。近年来，临床以四神煎为基本方加减治疗RA取得满意的疗效。名老中医岳美中先生善用四神煎治疗关节炎，并在《岳美中论医集》中称赞四神煎“随治随效”；冯兴华教授重视专病专方，推崇应用四神煎专治气阴两伤兼有瘀血、痰浊、湿热阻络之RA[4]。动物实验证明，四神煎联合甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)对RA的作用效果较单用MTX更佳[5]；不同剂量的四神煎汤剂均可缓解佐剂性关节炎大鼠足部肿胀，显著降低佐剂性关节炎大鼠血清炎症因子的水平，且可以改善肝肾功能，作用效果优于阳性对照药雷公藤多苷片[6]。然而，目前关于四神煎的物质基础及其治疗RA的作用机制仍未阐明。

网络药理学是基于系统生物学、计算机技术、药理学、医学等有机组合的新兴学科。基于生物信息学，构建“疾病-靶点-药物”的多级网络，分析它们之间的关联，进而在蛋白质、分子和基因水平上明确药物对疾病的作用机制[7]。本研究采用网络药理学方法，获取四神煎组方中药的主要活性成分，分析其治疗RA的主要作用靶点及相关通路，从物质基础和分子水平探索四神煎治疗RA的作用机制，为四神煎的临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 四神煎活性成分及其相关靶点筛选采用中医药百科全书数据库(encyclopedia of traditional chinese medicine，ETCM)[8]、中药系统药理学数据库和分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[9]检索并获取四神煎组方中药(黄芪、金银花、牛膝、石斛、远志)的化学成分，并结合文献进行筛选、补充。将所得到的化学成分名称输入Pubchem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)进行检索，获得化学成分的SMILES结构式及2D结构，导入Swiss ADME数据库，以胃肠吸收(gatrointestinal absortion)结果为“HIGH”，且五种类药性(lipinski、ghose、veber、egan、muegge)结果中有2个及2个以上是“YES”为标准进行筛选，所得化合物即为活性化合物。将筛选后的活性化合物的SMILES结构式或2D结构导入Swiss Target Prediction数据库[10]，研究对象设置为人源基因，筛选出置信度(probability)≥0.6的靶点。将得到的靶点去除重复后，导入Universal Protein(Uniprot)数据库[11]规范靶点名称，最终获得药物相关靶点。

1.2 RA疾病靶点筛选以“rheumatoid arthritis”作为关键词，在人类基因数据库(Gencards，https：//www.genecards.org)[12]、在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//www.omim.org)、治疗靶标数据库(therapeutic target database，TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)[13]及DrugBank数据库(https：//www.drugbank.ca)[14]中检索RA的潜在靶点。将从4个数据库中获得的靶点去除重复后，导入Uniprot数据库规范靶点名称，最终获得RA疾病靶点。

1.3 “药物-疾病”共同靶点的获取及蛋白互作(protein protein interaction，PPI)网络构建将四神煎活性成分相关靶点及RA疾病靶点导入生物信息学与进化基因组学(Bioinformatics & Evolutionary Genomics)在线软件作图工具平台(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)进行映射，获得“药物-疾病”共同靶点，即为四神煎活性成分治疗RA的关键靶点，并绘制韦恩图(Venn diagram)。应用String 11.0数据库(https：//string-db.org)[15]分析“药物-疾病”共同靶点之间的作用关系，设定Organism为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值(minimum required interaction score)为“highest confidence(>0.9)”，同时隐藏网络中的无关联节点(hide disconnected nodes in the network)，得到PPI网络。

1.4 基因本体(gene ontology，GO)生物功能分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 通路富集分析将“药物-疾病”共同靶点导入Metascape平台(https：//metascape.org/)[16]，分别进行基因本体(gene ontology，GO)生物功能分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 通路富集分析，设置P<0.01，将获得的数据结果应用微生信平台(http：//www.bioinformatics.com.cn)进行可视化，并将排行前20的条目绘制GO生物功能分析柱状图和KEGG通路富集分析气泡图。

1.5 “药物成分-靶点-信号通路”网络的构建应用Cytoscape 3.7.1软件构建“药物成分-靶点-信号通路”网络，然后应用网络分析仪(network analyzer)功能获得各成分、靶点的网络拓扑参数，获得四神煎发挥治疗RA作用的重要活性成分及核心靶点。

2 结果

2.1 四神煎活性成分及其相关靶点通过ETCM、TCMSP数据库并结合文献检索获得四神煎化学成分，经Swiss ADME数据库进行筛选后，共获得66个四神煎活性成分，其中金银花17个、黄芪16个、牛膝16个、远志9个、石斛8个，去除五味药物中重复成分后，最终获得槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、汉黄芩素(wogonin)等60个四神煎活性成分。将获得的60个活性成分的SMILES结构式或2D结构式上传至Swiss Target Prediction数据库，预测得到药物作用靶点，去除重复靶点后，共得到四神煎活性成分相关靶点353个。见表1。

表1 四神煎活性成分信息

表1 四神煎活性成分信息

2.2 RA疾病靶点以“rheumatoid arthritis”作为关键词，在GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank四个数据库中分别检索得到1084个、45个、128个、151个RA的潜在靶点。去除重复靶点后，将潜在靶点在Uniprot数据库进行基因名称规范，共获得1277个RA潜在靶点。

2.3 “药物-疾病”共同靶点及PPI网络应用Bioinformatics & Evolutionary Genomics在线平台将353个四神煎活性成分靶点与1 277个RA疾病靶点进行映射，并绘制Venn图，最终得到“药物-疾病”共同靶点151个。将获得的151个“药物-疾病”共同靶点上传至String 11.0数据库，构建PPI网络，该网络包含151个节点和616条边。见图1，图2。

图1 “药物-疾病”共同靶点Venn图

2.4 GO生物功能和KEGG 通路富集分析将151个“药物-疾病”共同靶点导入Metascape平台，进行GO生物功能分析和KEGG通路富集分析，以P<0.01为主要筛选标准，获得GO生物功能条目 2 322 条，其中生物过程(biological processes，BP)2 089 条，主要涉及细胞因子介导的信号通路(cytokine-mediated signaling pathway)、对脂多糖的应答(response to lipopolysaccharide)、对细菌源分子的应答(response to molecule of bacterial origin)、对有毒物质的应答(response to toxic substance)、对细菌的应答(response to bacterium)条；细胞组分(cellular components，CC)79条，主要涉及膜筏(membrane raft)、质膜筏(plasma membrane raft)、囊腔(vesicle lumen)、细胞外基质(extracellular matrix)、膜微区(membrane microdomain)等；分子功能(molecular functions，MF)154条，主要涉及细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、核受体活性(nuclear receptor activity)、细胞因子活性(cytokine activity)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)等。KEGG通路富集分析共获得174个信号通路，主要涉及白细胞介素-17信号通路(interleukin-17 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(tumor necrosis factor signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)等。见图3，图4及表2。

图3 KEGG通路富集分析气泡图

图4 GO分析柱形图

表2 KEGG通路富集分析结果

2.5 “药物成分-靶点-通路”网络的构建应用Cytoscape 3.7.1软件构建“药物成分-靶点-通路”网络图，该网络共有230个节点，978个相互关系。蓝色六边形代表药物活性成分，黄色菱形代表作用靶点，绿色V形代表信号通路；节点越大、颜色越深表示自由度(degree)度值越高。应用网络分析仪(network analyzer)功能分析网络中各成分、靶点的网络拓扑参数。degree度值反映网络中与该节点具有联系的节点数目，度值越高，参与的生物过程越多，可据此判断出四神煎发挥治疗RA作用的重要活性成分及核心靶点。主要活性成分的网络拓扑学分析结果显示，槲皮素degree度值为80，介度0.243 458，接近中心性0.484 848；木犀草素degree度值37，介度0.059 619，接近中心性0.408 759；山柰酚degree度值34，介度0.086 115，接近中心性0.414 815；汉黄芩素degree度值28，介度0.031 893，接近中心性0.392 982。主要靶点的网络拓扑学分析结果显示，degree度值最高靶点基因为PTGS2，degree度值为39，介度0.135 553，接近中心性 0.443 564；其次为PTGS1、RELA、TNF、NFKB1、JUN、MAPK14、MAPK1、ESR1、IL-6。表3及表4，见图5。

表3 主要活性成分网络拓扑学分析结果(degree度值前10位)

表4 主要作用靶点网络拓扑学分析结果

图5 “药物成分-靶点-通路”网络图

3 讨论

类风湿关节炎属中医“痹证”范畴，初起病因病机为素体亏虚、外感风寒湿热之邪，患者一般病程较长，风寒湿邪郁而化热，耗伤气阴，形成气阴两虚、邪气阻络之证[4]。四神煎作为临床治疗气阴两虚型RA的经典方剂，方中重用黄芪为君，振奋正气以驱散经隧深部之邪气；金银花可清热解毒；牛膝可补益肝肾兼通利关节；远志可祛痰消肿；石斛可养阴生津；诸药合用切中病机，既补已损之气阴，又驱除经络之郁邪。四神煎治疗RA的作用机制仍不清楚，因此，本研究将采用网络药理学方法分析四神煎治疗RA的潜在作用机制。

本研究共挖掘出四神煎活性成分60个，药物潜在靶点353个，RA疾病相关靶点1 277个，“药物-疾病”共同靶点151个。KEGG通路富集分析发现四神煎主要通过调控IL-17信号通路、TNF信号通路、Th17细胞分化、破骨细胞分化、NF-κB信号通路等生物学途径发挥抑制炎症和免疫反应、调节骨代谢的作用。①抑制炎症和免疫反应。TNF通路是RA发病机制中的经典通路，TNF-α作为通路中最早参与的细胞因子，可促进IL-1、IL-6 的分泌，刺激滑膜细胞产生基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，引起滑膜炎症。Th17细胞分化通路介导CD4+T细胞分化为Th17细胞，Th17细胞是以分泌IL-17为主的T细胞亚群，IL-17是RA患者关节滑膜损伤的重要因素之一，它可与IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子协同，募集中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞到关节局部浸润，引起滑膜组织增生[17-19]。NF-κB信号转导通路是引起炎症反应的重要信号通路，同时因为体内炎症因子的刺激会造成NF-κB的自分泌自扩增循环，进一步加重关节损坏[20]。②调节骨代谢。破骨细胞是骨骼系统中具备骨吸收功能的细胞，RA骨破坏的机制与破骨细胞的生成活化密切相关，抑制破骨细胞分化通路对于延缓RA骨破坏具有重要意义。人体内骨代谢的重要通路包括NF-MMPs受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)/NF-κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)/骨保护素(osteoprotegerin，OPG)信号通路和Wingless/Integrated(Wnt)信号通路等。IL-17通过介导RANKL表达，调控破骨细胞的分化，促进骨破坏的发生；还可促进软骨细胞中MMPs的分泌，分解软骨蛋白聚糖及胶原，破坏软骨组织[21]。TNF通过刺激骨细胞表达RANKL，激活破骨细胞形成，直接导致骨破坏[22]；还可通过上调Wnt信号通路拮抗剂DKK-1的表达，抑制成骨细胞介导的骨形成，间接导致骨破坏[23]。NF-κB 信号通路受到细胞因子(如RANKL、TNF-α 和IL-1)的严格调节，通过诱导破骨细胞分化破坏软骨细胞[24]。此外，关键靶点还富集在糖尿病并发症相关的AGE-RAGE信号通路、癌症通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化通路，提示四神煎对气阴两虚型糖尿病、癌症、动脉粥样硬化等疾病亦有治疗效果。

对四神煎主要活性成分进行网络拓扑分析发现，degree度值较高的活性成分为：槲皮素、木犀草素、山柰酚及汉黄芩素等。研究表明，槲皮素可以剂量依赖的方式减少RA成纤维样滑膜细胞中IL-6、IL-1β等细胞因子的分泌，抑制炎症反应[25]；还可通过抑制NF-κB信号通路下调MMP-13的表达，从而延缓RA软骨破坏，发挥保护软骨细胞的作用[26]。木犀草素可减少MMP的分泌，抑制炎症因子的表达[27]。木犀草素或木犀草素与绿原酸联用可显著下调IL-1β刺激的成纤维样滑膜细胞中信号转导因子糖蛋白130(glycoprotein 130，gp130)、Janus激酶1(janus kinases，JAK1)和信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcriptions 3，STAT3)的表达，进而抑制JAK-STAT信号通路的激活[28]。这些结果表明，木犀草素可抑制RA成纤维样滑膜细胞的增殖，阻断成纤维样滑膜细胞的致病作用。山柰酚通过拮抗碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)诱导的RSK2表达，抑制RA成纤维样滑膜细胞的增殖和迁移、Th17的分化和破骨细胞的形成[29]。汉黄芩素具有抗炎的作用，可以浓度依赖的方式增加RA成纤维样滑膜细胞内活性氧含量，进而降低关节炎症反应[30]。由此推测，槲皮素、木犀草素、山柰酚、汉黄芩素等成分可能是四神煎治疗RA的重要活性成分，且这些成分可通过抑制炎症和免疫反应、调节骨代谢发挥治疗作用。

对四神煎治疗RA的作用靶点进行网络拓扑分析发现，degree值较高的PTGS2、PTGS1、TNF、IL-6等均为RA临床常用药物的作用靶点。前列腺素内过氧化物合酶(prostaglandin endoperoxidase synthase，PTGS)也称环氧合酶(cyclooxy genase，COX)，是目前临床治疗RA常用的非甾体类抗炎药的作用靶点，其中PTGS1(COX-1)可参与调节机体正常生理活动；PTGS2(COX-2)可在IL-6、TNF-α等细胞因子的诱导下迅速表达，催化前列腺素(prostaglandin，PG)参与炎症反应[31]。TNF抑制剂和 IL-6 受体拮抗剂为临床常用生物制剂，可较快缓解病情、降低疾病活动度[32]。TNF包括TNF-α和TNF-β，TNF-α是RA发病过程中最早参与的细胞因子，参与机体免疫或炎症反应，诱导促进 IL-1、IL-6和MMPs的释放，激活破骨细胞分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝。滑膜成纤维细胞在炎症因子的刺激下可分泌IL-6，IL-6可诱导Th17和破骨细胞分化，促进急性期蛋白合成，增强与滑膜增生和关节破坏有关的炎症反应[22]。

综上所述，四神煎可通过多成分、多靶点、多通路抑制炎症和免疫反应、调节骨代谢发挥对RA的治疗作用。本研究为后续开展四神煎的机制研究提供线索，为四神煎的临床应用提供理论基础。但由于网络药理学研究是基于数学模型及生物信息学的研究方法，未涉及药代动力学、血清药物化学等领域，故仍存在一些问题亟待解决，比如药物提取浓缩过程中化学成分的变化、药物在人体内代谢发生的变化、药物之间的配伍关系等，因此本研究结果需经过动物或细胞实验进一步验证，为四神煎治疗RA提供更坚实可靠的科学依据。