抗雌激素多克隆抗体的制备及效价鉴定

卢科宇，闫冰洁，田 贞，何凤琴，范思媛，李晓茹，常亦昆

(1.西安市秦岭天然产物开发与抗癌类创新药物研究重点实验室;西安文理学院基因工程实验室;西安文理学院生物与环境工程学院，西安710065；2.郑州大学 医学院，郑州 450052)

雌二醇(Estradiol，E2)是一种类固醇激素，通过卵巢颗粒细胞中的芳香化酶系统从睾酮中产生[1]，它有助于青春期和月经周期的第二性征的发育[2]．在人类雌二醇水平的增高和降低对于卵巢等其他疾病有重要的临床意义；在兽医临床则用于同期发情，而在动物喂养中加入雌二醇，可以促进生长及提高畜禽瘦肉量[3]．但雌二醇在动物组织内的残留问题所带来的危害不容忽视．雌二醇残留会通过食物链危害人类健康，可能会造成女性幼儿提前发育，男性儿童乳腺发育成女性化，男性生殖系统发育异常与病变[4]．因此肉与肉制品中雌二醇的检测成为了人类食品安全的必要措施．

本研究为建立雌二醇在肉及肉制品中的快速检测，通过将半抗原雌二醇合成为雌二醇-3-羧甲基醚(E2-3-CME)，再通过碳二亚胺(EDC)法与牛血清白蛋白(BSA)结合，合成完全抗原 ( E2-BSA)．将E2-BSA免疫雌性家兔，制备出抗雌激素的多克隆抗体．通过用酶联免疫吸附(Elisa)实验对产生的多克隆抗体进行效价鉴定．该抗体的成功制备为以后开发动物源性食品药物残留检测新技术提供了帮助．

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

雌二醇(E2，武汉远程科技发展有限公司)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)；牛血清白蛋白(BSA，武汉博士德)，二抗IgG (羊抗兔，武汉博士德)、弗式完全/不完全佐剂(武汉博士德)，无水二甲基亚砜，KOH，溴乙酸，乙酸乙酯，HCl，DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，甲醇，丙酮，0.01 M PBS，3%蔗糖，纤维素透析袋(源叶生物，SP131060).

1.1.1 制备0.01 M PBS

试剂配方：称取8.0 g NaCl，0.2 g KCL，3.6 g Na2HPO4.12H2O． 0.24 g KH2PO4，加超纯水900 mL，调pH至7.4后加超纯水至1000 mL．

1.1.2 制备10 mg/mL BSA溶液

称取10 mg的BSA溶于1 mL的0.01M PBS．

1.1.3 制备3%蔗糖溶液

称取3 g蔗糖溶于100 mL的超纯水．

1.2 主要仪器设备

恒温水浴锅(Sheldon Manufacturing)，倒置显微镜(OLYMPUS)，高压蒸汽灭菌锅(ZEALWAY)，离心机(湘仪)，振荡器(SI Vortex-Genie)，1 mL、20 mL注射器(博士德生物公司)，酶标仪(Bio-Tek，Winooski).

1.3 实验动物

清洁级雌性家兔3只(体重2～2.5 kg)，购自西安交大医学院．

1.4 实验方法

1.4.1 雌二醇半抗原(雌二醇-3-羧甲基醚，E2-3-CME)的制备

将300 mg(1.0 mmol)雌二醇搅拌溶于6 mL无水二甲基亚砜，再加入1 g(18 mmol)KOH粉末，搅拌5 min，上述固体完全溶解后，加入300 mg溴乙酸，继续搅拌反应2 h，加入50 mL冰水终止反应．加入乙酸乙酯进行萃取，除去未反应的E2，其中下层水相用2 mol/l HCl酸化，出现白色沉淀物，即为雌二醇-3-羧甲基醚(E2-3-CME)粗品．过滤，用双蒸水洗涤，真空干燥2天，最终经甲醇-丙酮重结晶，得到无色晶体即为E2-3-CME纯品．

1.4.2 雌二醇完全抗原的制备

经过上述实验获得8 mg E2-3-CME，加入4.24 mg NHS，7.08 mg EDC，混合并溶于8 mL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，避光震荡活化反应8 h，逐滴加入10 mg/mL BSA溶液，出现絮状沉淀立即停止，4℃震荡反应过夜，用0.01M PBS透析三天．此时，透析袋中即为雌二醇完全抗原(E2-BSA)．雌二醇完全抗原冷冻干燥后，-20℃保存备用．

1.4.3 免疫动物及免疫血清的采集

将2～2.5 kg 的清洁级雌性家兔，适应性饲养1周后，在免疫前对家兔进行耳缘静脉采血2 mL，并将血液经20 000 r/min离心5 min，收集血清作为阴性对照．第二周(第一次)将0.4 mL E2-BSA，与等量的弗氏完全佐剂混合，将混合物在振荡器上充分振荡，使其完全乳化．在家兔背部选取 4～5个点，在皮下进行多点注射免疫动物，第三周(第二次)和第四周(第三次)同上，但用弗氏不完全佐剂替代弗氏完全佐剂，如表1所示．在每次免疫之前先采集血清作为第一次、第二次和第三次免疫后的阳性血清，其中第一次、第二次的阳性血清通过耳缘静脉采血离心后获得，第三次阳性血清通过心脏采血获得，共计采血四次，一次阴性对照，三次阳性实验．收集后的血清，-80℃保存，备用．

表1 不同周次抗原和免疫佐剂的免疫剂量

1.4.4 通过Elisa检测抗体血清的效价

1.4.4.1 包被抗原

抗原E2-BSA用0.01M PBS稀释，最终浓度为1 μg/mL．稀释完成后，在酶标板上按每加样孔100/μL加样包被．加样完成后，用封闭膜封闭加样孔，防止蒸发并放置4℃冰箱过夜．

1.4.4.2 封闭

取出过夜处理的酶标板，用超纯水将加样孔洗三遍，在干燥的吸水纸上拍打，拍出多余的水分．随后向加样孔加入1% BSA溶液，200 μL/孔，同样用封闭膜封闭加样孔并放置4℃冰箱过夜．

1.4.4.3 加一抗

过夜处理完成后，将酶标板加样孔水分甩干，将具有抗体的血清用0.01M PBS按照1：1 000的比例进行稀释．将稀释后的血清和0.01 M PBS 100 μL分别加入到酶标板的加样孔中，加入血清的为实验组，加入PBS的为对照组，加样完成后，用封闭膜封闭，放置37℃恒温水浴锅，孵育1 h．

1.4.4.4 加二抗

孵育完成后，用超纯水洗三遍，在干燥的吸水纸上拍打，拍出多余的水分．随后向加样孔中加二抗IgG，每孔50 μL，用封闭膜封闭，放置37℃恒温水浴锅，孵育1 h．

1.4.4.5 显色

孵育后的酶标板，用超纯水洗3次，在吸水纸上拍打，拍出多余水分．加入显色液，100 μL/孔，用封闭膜封闭，放置37℃恒温水浴锅，孵育15 min．孵育结束后用50 μL/孔的1 M H2SO4终止显色反应．

1.4.4.6 读取数据

将酶标板放在酶标仪中，在450 nm处测定OD值，读取并记录各加样孔OD值．

1.5 统计学方法

所有实验数据均采用均值±标准差(x±s)表示．应用SPSS 13.0 统计软件进行单因素方差(ANOVA)分析，以Post Hoc法进行组间两两比较，P< 0.05 为差异有统计学意义．

2 结果

三只兔子经过三次雌二醇完全抗原的免疫，三只兔子在第一次、第二次免疫后血清抗体的OD值与免疫前的血清进行比较均没有明显的差异(P> 0.05)，且在第一次、第二次免疫后血清抗体的OD值之间也无明显差异(P> 0.05)，但在第三次免疫后血清抗体的OD值比没有进行免疫和第一次、第二次免疫后血清抗体的OD值均有极明显升高(P< 0.01)(表2).

表2 不同周次免疫前后OD值的比较

表2显示将三只兔子分别在第一次，第二次和第三次免疫后血清抗体的OD平均值分别作为实验的三个组，三只兔子免疫前的血清OD平均值，作为对照组进行比较，同样，三只兔子在第一次、第二次免疫后血清抗体的OD值与对照组的血清抗体进行比较均没有明显的差异(P> 0.05)，且在第一次、第二次免疫后血清抗体的OD值之间也无明显差异(P> 0.05)，但在第三次免疫后血清抗体的OD值比对照组和第一次、第二次免疫后血清抗体的OD值均极明显升高(P< 0.01)(图1)．

图1 三次免疫后血清抗体的OD值注：**： P< 0.01，具有极明显差异．

3 讨论

本次实验选用雌二醇作为免疫原，雌二醇的分子量为 (272.38)，属于小分子物质，具有抗原性但不具有免疫原性，必须与大分子蛋白偶联，通过大分子蛋白上的 T 细胞表位间接诱导 B 细胞产生针对雌二醇的特异性抗体，常用的载体蛋白有BSA、鸡卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HAS)等[1]，本次实验使用的是BSA．本实验不足之处是没有在制备完完全抗原后对其进行检测和鉴定．

为了增强免疫原性，在动物进行免疫之前注入免疫佐剂，简称佐剂[5]．弗氏佐剂是将抗原水溶液与油剂(石蜡油或植物油)等量混合，再加乳化剂(羊毛脂或叶吐温 80)制成油包水抗原乳剂，称之为不完全弗氏佐剂．如在不完全佐剂中加入分枝杆菌(如死卡介苗)则称为完全弗氏佐剂[5]．一般免疫动物第一次注射用抗原+完全弗氏佐剂(比例为1∶1)，第二次，第三次等用抗原+不完全弗氏佐剂(比例为1∶1)，从免疫后的动物获得血清后要鉴定抗体的效价[2]．不管是用于诊断还是用于治疗，制备抗体的目的都是要求较高效价．不同的抗原制备的抗体，要求的效价不一．鉴定效价的方法很多，包括有试管凝集反应、琼脂扩散试验、Elisa等[6]．Elisa法操作简便、廉价、快速、通量高，又能进行定量测定，在抗生素、雌激素、农药残留检测领域有着广泛的应用[7]．在本实验中，注射三次E2-BSA产生的抗体光密度值(OD)最高，且与对照组，注射第一次和第二次产生的抗体的OD值均具有明显差异．可能是抗体的产生具有潜伏期、对数期、平台期和下降期[8]，注射三周E2-BSA产生的抗体可能处在抗体产生的对数期，而注射一周和两周产生的抗体可能处在对数期以外的其他时期，故而检测的抗体OD有所不同．通过抗原免疫三次的家兔产生的抗体效价最高，可为后期通过此方法制备抗体和Elisa试剂盒奠定基础．

为了保障人类的食品安全和身体健康，快速高效的检测技术是关键．同时，检测技术的完善能够促进畜牧业的快速发展，推动国内的养殖业迅速与国际接轨[9-10]．