响应面法优化白芷中欧前胡素的提取工艺*

黄 琼, 李媛媛, 石锦峰, 许锦涛, 董自波,2

白芷为伞形科植物白芷或杭白芷的干燥根, 性温、 味辛,归胃、 大肠、 肺经, 具有治疗风寒头痛、 鼻渊、 鼻塞、 消肿排脓等功效[1]。 文献报道其有效镇痛成分主要为欧前胡素、 异欧前胡素等香豆素类[2]。 2020 年版《中国药典》评价白芷质量以欧前胡素为指标, 白芷所含欧前胡素的总量不得少于0.080%。但欧前胡素具有热不稳定性, 不同提取条件对欧前胡素提取率影响较大, 故本研究通过HPLC 法测定欧前胡素的含量[3-5],在单因素试验基础上确定影响欧前胡素提取率的三水平三因素, 通过Box-Behnken Design 响应面法优化白芷中欧前胡素的提取工艺, 以期为相关研究提供理论依据。

1 材 料

1.1 仪 器

JJ444BC 型电子分析天平, 上海赛多利斯贸易有限公司;ZNCL-GS 智能磁力搅拌器, 上海凌科实业发展有限公司;Mettler Toledo AL104 电子天平, 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 试剂与药物

白芷, 安徽省亳州市药材总公司中西药公司; 欧前胡素对照品, 中国食品药品检定研究院; 磷酸(批号: 20200805), 国药集团化学试剂有限公司; 甲醇和乙腈, 上海麦克林生化科技公司。

2 方法与结果

2.1 欧前胡素的HPLC 法测定

2.1.1 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm); 流动相: 乙腈-0.1%磷酸水溶液(60∶40); 体积流量: 1.0 mL/min; 检测波长: 254 nm; 进样量: 20 μL。 理论塔板数按欧前胡素峰计不低于5000。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称量欧前胡素对照品15 mg, 置于50 mL 棕色的量瓶中, 加甲醇溶解后, 定容至刻度线, 摇匀, 再精密移取5 mL至25 mL 的容量瓶中, 加甲醇溶解后, 定容至刻度, 摇匀, 得对照品溶液, 封口膜封口, 4 ℃冰箱保存备用。

2.1.3 供试品溶液的制备

精密量取水提液10 mL, 置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇10 mL, 摇匀, 滤过, 用0.45 μm 的微孔滤膜滤过得续滤液,即为供试品溶液。

2.1.4 专属性试验

精密吸取甲醇溶液(阴性对照溶液)、 欧前胡素对照品溶液和水提液供试品溶液各20 μL, 分别进样, 结果见图1 ～图3。谱图显示供试品与对照品溶液在相同的保留时间处有对应的色谱峰, 且阴性对照溶液与供试品溶液、 对照品溶液在相同的保留时间处无对应的色谱峰, 表明专属性较强。

图1 白芷供试品溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of the solution of the test substance of Angelica dahurica

图2 欧前胡素对照品溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of imperatorin reference substance solution

图3 阴性对照溶液色谱图Fig.3 Chromatogram of negative control solution

2.1.5 线性关系考察

分别精密吸取“2.1.2” 项下配制的对照品溶液各0.1、0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 mL 置于1 mL 量瓶中, 即分别稀释10、 5、 2.5、 1.67、 1.25、 1 倍, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀,得稀释后的5 份对照品溶液, 按“2.1.1” 项下色谱条件进样测定, 记录峰面积积分值, 以质量浓度为横坐标(X), 对照品峰面积为纵坐标(Y), 绘制标准曲线, 建立得出回归方程, 欧前胡素回归方程为Y=133090.999X+1413.311, R2=0.9998,线性范围6.106 ～48.848 μg/mL。

2.1.6 精密度试验

按“2.1.2” 项下方法制备一份对照品溶液, 按“2.1.1”项下色谱条件测定, 连续平行进样6 次, 测定对照品中欧前胡素的峰面积, 记录色谱图中的积分值。 峰面积积分值RSD 为0.37%＜5%, 结果说明仪器精密度良好, 符合要求。

2.1.7 稳定性试验

按“2.1.3” 项下方法制备一份供试品溶液, 于处理后0、2、 4、 6、 8、 12、 24 h 分别进样测定, 按“2.1.1” 项下色谱条件测定, 测定不同处理时间的欧前胡素峰面积, 记录色谱图中的积分值。 结果欧前胡素峰面积RSD 值为0.12%, 表明在24 h 内, 供试品溶液稳定性良好, 符合要求。

2.1.8 重复性试验

按“2.1.3” 项下方法制备一份供试品溶液, 按“2.1.1”项下色谱条件测定, 连续平行进样6 次, 测定供试品中欧前胡素的峰面积, 记录色谱图中的积分值。 峰面积RSD 为0.19%＜5%, 结果说明说明该方法重复性良好, 符合要求。

2.1.9 回收率试验

精密量取同一批水提液6 份, 每份10 mL, 分别精密加入对照品欧前胡素相当于样品中欧前胡素含量的100%, 按“2.3.2” 项下方法, 制备供试品溶液, 按“2.3.1” 项下色谱条件测定并计算回收率, 欧前胡素平均加样回收率分别为97.13%, RSD 为0.59%, 表明此方法的准确度良好。

2.2 水提取工艺的单因素考察

白芷采用水提法, 以欧前胡素提取率为指标, 考察加热温度、 料液比、 提取时间三个因素因素对提取结果的影响[6]。

2.2.1 提取温度的考察

称取白芷饮片30 g, 置于圆底烧瓶中, 加10 倍量的水, 加热温度分别为40、 50、 60、 70、 80 ℃, 水浴加热提取1.5 h,提取1 次, 各平行3 份, 按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液, 按“2.1.1” 项下色谱条件测定, 分别进样, 记录色谱图。采用外标法计算欧前胡素提取率, 结果见图4。

图4 不同提取温度对欧前胡素提取率的影响Fig.4 The effect of different extraction temperatures on the extraction rate of imperatorin

2.2.2 料液比的考察

称取白芷饮片30 g, 置圆底烧瓶中, 分别加6、 8、 10、12、 15 倍水, 60 ℃水浴加热回流提取1 h, 提取1 次, 各平行3 份, 按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液, 按“2.1.1” 项下色谱条件测定, 分别进样, 记录色谱图。 采用外标法计算欧前胡素提取率, 结果见图5。

图5 不同料液比对欧前胡素提取率的影响Fig.5 The effect of different material-to-liquid ratios on the extraction rate of imperatorin

2.2.3 提取时间的考察

称取白芷饮片30 g, 置圆底烧瓶中, 加10 倍水, 分别60 ℃水浴加热提取0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 3.0h, 提取1 次, 各平行3 份, 按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液, 按“2.1.1” 项下色谱条件测定, 分别进样, 记录色谱图。 采用外标法计算欧前胡素提取率, 结果见图6。

图6 不同提取时间对欧前胡素提取率的影响Fig.6 The effect of different extraction times on the extraction rate of imperatorin

2.2.4 Box-Behnken 试验设计与结果

通过单因素试验考察后, 确定三个影响因素及其因素水平。 因素水平见表1。 在此基础上, 设计Box-Behnken 响应面试验[7], 响应面试验设计及结果如表2 所示。 通过Design-Expert 8.0 软件建立响应面分析模型。

表1 提取工艺响应面试验三因素三水平表Table 1 Extraction process response surface test three factors and three levels table

表2 BBD 响应面法试验结果Table 2 BBD response surface method test results

2.2.5 回归模型有效性及显著性分析

将表2 试验条件及结果导入Design Expert 8.0 软件进行回归分析。 欧前胡素提取率(Y)对A、 B、 C 的多项二次回归模型方程为Y=0.95+0.13A-0.009B+0.005C+0.009AB-0.048AC-0.007BC-0.31A2+0.005B2-0.033C2, 通过方差分析考察其显著性, 结果见表3。 由表3 及表4 可知, 失拟项P=0.5082 ＞0.05, 模型P＜0.0001, r2=0.9913, 表明回归模型极具显著性,拟合程度好。 由方差分析P 值可知, A 因素影响极具显著性;交互项AB、 BC 因素对综合得分影响不显著, AC 因素影响极具显著性; 二次项A2因素对综合得分影响极显著, C2因素影响具显著性, B2因素影响不显著。 由方差分析单因素F 值可看出, B、 C 因素对综合得分影响较小, A 因素最大。 综上所述,各因素的影响顺序为C＜B＜A。

表3 欧前胡素提取率响应面方差分析结果Table 3 Response surface variance analysis results of imperatorin extraction rate

模型P 值＜0.05 表示显著, 失拟项P 值＞0.05 表示不显著,即该模型在被研究的回归区域内拟合较好; 多元相关系数值R2越大, 说明相关性越好; CV＜10%, 表示试验的可信度和精确度较高; 精密度(Adeq Precision)是有效信号与噪声的比值, ＞4视为合理[8]。 从表4 可以看出, 试验的拟合回归方程符合以上几个原则, 适应性较好。

表4 欧前胡素提取率回归方程误差统计分析Table 4 Error statistical analysis of the regression equation of imperatorin extraction rate

2.2.6 等高线图和3D 响应面图分析

根据拟合的方程, 采用Design-Expert 8.0 软件绘制不同变量之间对欧前胡素提取率影响的等高线图及3D 效应面图, 如图7 ～图9 所示。

图7 提取温度与料液比对欧前胡素提取率的交互影响Fig.7 Interactive influence of extraction temperature and material-to-liquid ratio on the extraction rate of imperatorin

图9 提取时间与料液比对欧前胡素提取率的交互影响Fig.9 Interactive influence of extraction time and material-to-liquid ratio on the extraction rate of imperatorin

图8 提取温度与提取时间对欧前胡素提取率的交互影响Fig.8 Interactive influence of extraction temperature and extraction time on the extraction rate of imperatorin

各变量间的相互作用可通过圆形或椭圆形的等高线图形状和三维曲面图坡度反映, 因素间交互作用显著, 则等高线的形状为椭圆形, 交互作用不显著则为圆形[9], 因素间交互作用强则二维平面图等高线呈椭圆形且密集, 三维曲面图陡峭且坡度大, 也可说明结果有统计学意义[8]。 图8 中二维平面图等高线呈椭圆形且密集, 三维响应曲面坡度大, 说明A 因素与C 因素之间交互作用强, 图7 和图9 中二维平面图等高线虽密集但不近似椭圆形, 说明AB 因素与BC 因素之间交互作用弱, 与方差分析结果相符。

2.2.7 响应面模型验证

根据软件结果分析白芷中欧前胡素的最佳提取条件为: 提取温度71.93 ℃、 液料比8 倍、 提取时间1.5 h, 在该条件下欧前胡素提取率为0.9752%。 为了实际操作更方便, 将优化后的提取工艺调整为: 提取温度72 ℃、 液料比8 倍、 提取时间1.5 h, 进行3 次平行试验, 在这些条件下进行试验所测得的白芷欧前胡素提取率为0.97%±0.05%, 实验值与理论值误差较小。

3 结 论

本研究在单因素试验的基础上, 采用BBD 响应面试验设计优化白芷中欧前胡素的提取工艺。 结果表明, 建立的二元多项式回归方程拟合的情况较好, 根据实际操作对分析得出的预测值进行调整为提取温度72 ℃、 液料比8 倍、 提取时间1.5 h,在此条件下白芷中欧前胡素提取率为0.97%±0.005%, 说明白芷中欧前胡素提取率可用该模型进行预测, 结果具有一定的理论价值与实际应用前景。