固相萃取中的常见问题和解决办法

2022-04-26朱学多杨义勇兰苗宇陆书来

合成材料老化与应用 2022年2期

朱学多,杨义勇,于佳,陈明,兰苗宇,陆书来

（1中国石油ABS技术中心,吉林省吉林市 132021；2中国石油吉林石化公司合成树脂厂，吉林省吉林市 132021）

对分析检测人员来说，样品前处理是至关重要的一环，其占整个分析过程的60%以上的时间，主要的分析误差也来自样品前处理环节。固相萃取（Solid Phase Extraction，简称SPE）作为样品前处理的技术之一，得到了越来越广泛的应用，并在此基础上，发展出了固相微萃取（SPME）、基质固相分散萃取（MSPDE）、免疫亲和（IAC）固相萃取、分散固相萃取（DSPE）和分子印迹固相萃取（MISPE）等新型样品前处理技术［1］。

本文介绍了固相萃取技术的定义、分类、用途、特点和应用，总结了常见问题及其解决方法，以期为使用固相萃取技术的工作者提供帮助。

1 固相萃取简介

固相萃取由液固萃取柱和液相色谱技术相结合发展而来，利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的一种样品前处理技术。根据使用固相萃取的目的，可以将固相萃取分为两类：目标化合物吸附模式固相萃取和杂质吸附模式固相萃取。固相萃取具有分离、净化、浓缩及转换溶剂等作用。

2 固相萃取的特点

2.1 固相萃取与液-液萃取的比较

液-液萃取（LLE）虽然是目前使用最广泛的样品前处理技术之一，但其在实际操作中还存在一些问题。例如：萃取结果严重依赖操作人员的熟练程度；大量使用有机溶剂；乳化层中的目标化合物难于分离；劳动强度大；费时间；难以实现自动化操作［2］。

相对于液-液萃取，固相萃取正好弥补了上述不足，具有如下优点：(1)给定一个固相萃取方法，操作人员比较容易重现实验结果。(2)在固相萃取中，有机溶剂的使用量比经典的液-液萃取少得多。(3)固相萃取中没有乳化问题。(4)目前固相萃取填料有许多不同的种类，可以选择性地分离萃取某类指定的目标化合物。(5)已经实现了自动化操作。

2.2 固相萃取与高效液相色谱的比较

虽然固相萃取和高效液相色谱（HPLC）都是通过液体中的目标化合物在固体填料上进行的吸附及脱附达到分离目的，但两者之间还是有区别。首先，两者的目的不同。HPLC的主要目的是在尽可能短的时间里实现对样品的定性或者定量分析。而固相萃取的主要目的是为了在其他分析设备上实现对样品的定性或者定量分析而对目标化合物进行分离、净化或者浓缩。其次，化合物在两种柱上的行为不同。在HPLC中，样品进入色谱柱后首先在柱头聚集，随着流动相连续不断地进入，化合物在色谱柱上连续不断地在固相与液相之间分配以达到分离的目的，这个过程直到化合物流出色谱柱才停止。而化合物在SPE柱上的行为则不同，样品基质就是流动相。由于SPE柱的填料高度一般都很短，化合物在SPE柱上几乎没有分离，要么被吸附，要么随基质流过。因此，固相萃取是无法分别将混合物中的各组份分离开的。但在某种条件下，固相萃取可以将不同类别的混合物分离。SPE与HPLC的主要区别见表1［2］。

表1 固相萃取与高效液相色谱的对比Table 1 Comparison of solid phase extraction and high performance liquid chromatography

2.3 固相萃取的局限性

每种样品前处理方法都有一定的局限性，固相萃取也不例外。对于固相萃取，样品必须呈液态或气态，否则，样品无法通过固相萃取柱，只能通过一定的方法，将目标化合物转移至液体中，然后才能进行固相萃取。

3 固相萃取的应用

固相萃取技术发展到现在，已经在环保分析、食品分析、生命科学和司法鉴定等领域得到应用。

黄思静等［3］采用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）同时测定水体中7种青霉素残留。水样经Oasis HLB固相萃取小柱富集和净化后，用反向C18色谱柱分离，以0.1%的甲酸水溶液和乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾离子源正离子模式进行检测。7种青霉素类化合物在1.0~20.0 μg/L的线性范围内，相关系数r均大于0.99，检出限为1~10 ng/L。实际水样加标回收率为91.15%~106.36%，相对标准偏差为2.30%~8.47%，均小于10%。罗斌等［4］采用固相萃取-气相色谱质谱法测定地表水中硝基氯苯残留量，并通过萃取条件优化，选择HLB柱为固相萃取柱，正己烷：丙酮（体积比3：2）溶液为洗脱剂。实验结果表明，该方法具有实用性强、操作简便快捷、重复性好、灵敏度高、定性定量结果准确可靠等优点，满足了地表水中硝基氯苯类物质残留量的检测需要。

杨俊等［5］通过优化固相萃取柱和气相色谱-质谱联用法的分离条件，建立了一种气相色谱-质谱联用(GC-MS)表明，在0.2~10 μg/mL线性范围内，9种COPs的相关系数(R2)均大于0.998，方法检出限低于0.00015mg/kg。3个加标水平(0.5、1、5 mg/kg)的回收率在79.6%和101%之间，相对标准偏差(RSD)低于5%(n=3)。该法具有较高的灵敏度和准确性，可成功应用于食品中9种COPs的含量检测。张家华等［6］将鸡肉、猪肉组织样品通过甲醇-乙腈（体积比1：1）提取和C18固相萃取柱净化处理后，进行梯度洗脱，电喷雾电离，在正离子、多反应检测模式下进行检测分析，建立了用于猪肉、鸡肉中睾酮、甲睾酮、黄体酮等11种同化激素残留量检测的超高效液相色谱-串联质谱法。结果表明，11种目标分析物在实验浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.99；在10、20、50 μg/kg浓度水平下，猪肉中11种同化激素的平均回收率为74.3%~101.1%，鸡肉中11种同化激素的平均回收率为70.1%~97.4%。11种同化激素在猪肉、鸡肉中检测限和定量限分别为0.1~0.5 μg/kg和0.3~1 μg/kg，变异系数均小于15%。所建立的方法灵敏度高、特异性强，可用于猪肉、鸡肉中睾酮等11种同化激素的残留检测分析。

蓝月［7］采用固相萃取技术，以二氧化硅纳米粒子为DNA分离纯化的新型固相吸附剂，建立了一种快速、高效的DNA分离纯化方法，实现了全血中DNA的自动化在线萃取。陈贝贝［8］开发了适合于元素形态分析的新型样品前处理技术，建立了新型混合涂层改性中空纤维膜管内固相微萃取及磁固相萃取与HPLC-ICP-MS联用新方法，并成功用于生物样品中元素形态分析。提出了芯片磁固相微萃取技术与ETV-ICP-MS联用新方法，并成功应用于细胞分析及蛋白质定量，为金属组学研究提供了新的技术平台。

张春水等［9］对吸食过量海洛因死亡者的尿液进行固相萃取处理后，用GC/MS分析，成功从尿液中检测出海洛因合成副产物单乙酰可待因和海洛因代谢产物吗啡，这两种物质同时存在于尿液中，基本认定被测者吸食了海洛因毒品。Strayer K E等［10］采用固相萃取法净化富集了血液中24中芬太尼类物质，回收率为60.0%~95.0%。固相萃取法是生物样品中芬太尼类物质提取和富集最常用的前处理方法。

4 固相萃取常见问题与解决办法

固相萃取中常见的问题主要有以下四个方面：流速问题、回收率问题、污染问题和非萃取问题。

4.1 流速问题

稳定的流速对SPE来说十分重要，尤其在样品过柱和洗脱步骤，直接影响目标化合物的回收率。流速过快会降低目标化合物的回收率；流速过慢会增加分析时间，降低工作效率。

影响流速的因素主要有以下几个方面：

（1）隔片。SPE柱上下两个隔片的作用是固定填料。隔片的孔径大小不一或者大小不合适，会对流速产生负面影响。如果其边缘切割的不好，液体就会沿着隔片边缘沿着柱子内壁流过，而不是通过填料；在运输或使用过程中也可能会出现填料流失的现象。隔片本身材质的亲水性或疏水性对流速也有影响。

（2）装柱过程。萃取柱的填料装填过密会限制流速，装填过松则会导致流速过快，造成回收率和选择性方面出现问题。

（3）外力。外力不稳定会造成液体过柱流速的不稳定。

（4）样品本身。样品本身的黏度和颗粒数量都对流速有影响。黏度大或者样品中的颗粒较多都会造成隔片微孔的部分或者全部堵塞，进而影响液体过柱的流速。对于黏度大的样品，可对其稀释来解决。需要注意的是，稀释液本身不能含有大量与目标化合物竞争的成分，通常选用适当的缓冲溶液对样品进行稀释，并注意缓冲溶液的用量。对于存在大量颗粒的样品，可采用过滤和离心的方法去除。

4.2 回收率问题

在SPE中，流速能够直接影响最终的结果，因此，要适当注意流速问题，尤其是样品过柱和溶剂洗脱时的流速。除此之外，还应注意具体操作中出现的影响因素。

经典的SPE方法包括以下五个步骤：萃取柱预处理；样品过柱；萃取柱洗涤；萃取柱干燥和目标物洗脱。这五个步骤中的每一步都可能影响方法的回收率和结果的重现性。

（1）萃取柱预处理。在这个步骤中，要选择适当的溶剂，以便有效地活化SPE柱。溶剂的用量不能过少，用量过少可能导致萃取柱未能充分活化。溶剂流速过快，会形成“沟壑效应”，降低吸附剂与样品接触的表面积，导致吸附剂容量的明显下降，进而导致回收率降低。如果填料已经形成了“沟壑效应”，最好弃用。萃取环境的pH值和离子强度对目标化合物从样品基质中转移到萃取吸附剂上也十分重要。通常SPE柱预处理的pH值应该与样品的pH值相同。

（2）样品过柱。在这一步骤中，最常见的问题是“柱穿透”，即目标化合物没有被SPE柱的填料保留，而是随着样品基质一起流过SPE柱。这样势必造成回收率降低。造成柱穿透的因素主要有：样品流速过快；萃取柱预处理条件不合适；加入不合适的溶剂（离子强度、有机强度等）；体积超载，保留弱的目标化合物随基质流失；质量超载，柱容量不够（目标化合物+基质）；萃取填料不适合目标化合物的保留。其中，样品过柱的流速影响是最大的。过快的流速导致柱穿透。但样品过柱的流速并非越慢越好，流速过慢可能会导致样品基质中的其他成分被保留，从而导致干扰物增加，回收率降低。

（3）萃取柱洗涤。在这个步骤中，容易出现目标化合物流失的问题，造成这一问题的主要原因有两个：目标化合物在萃取柱上的保留不够强，洗涤时，部分目标化合物随溶剂流出萃取柱；所选用的洗涤溶剂对目标化合物的洗脱能力太强，在洗涤干扰物的同时，也洗脱了目标化合物。

（4）萃取柱干燥。干燥的目的是去除残留的水分和水溶性干扰物。但要注意，过分干燥可能造成目标化合物的流失。

（5）目标物洗脱。洗脱溶剂的洗脱强度应该是以能够完全破坏目标化合物与填料之间的键合为基准。这一步骤中，流速的控制也很重要，必须保证有足够的时间让洗脱溶剂与目标化合物进行作用，将目标化合物从吸附剂的官能团中释放出来。要注意洗脱条件是否恰当，例如pH值、极性、溶解度等。

4.3 污染问题

SPE柱的污染在很大程度上取决于目标化合物的浓度范围和所使用的检测手段。SPE柱本身最常见的污染来源于萃取柱的聚乙烯针筒、聚乙烯隔片以及填料中的各种聚合物残留和邻苯二甲酸酯。这些干扰物可能干扰对目标化合物的检测，应该对SPE柱进行预清洗。

4.4 非萃取问题

当回收率偏低时，要对包括样品前处理在内的每一步进行分析，找出原因。在对萃取方法进行检查之前，首先要排除由于检测方法或条件选择的不正确引起的问题。其次要考虑的非萃取问题是浓缩蒸发，即目标化合物在加热条件下是否稳定。如果目标化合物在所溶解的溶剂中易挥发，可以降低浓缩温度或加入沸点较高的溶剂。这些溶剂可以吸收热量，防止低沸点化合物在浓缩蒸发过程中发生损失。