3种兰科植物种子非共生萌发成苗比较

张 娜， 曹小勇,2*， 胡选萍,2， 秦公伟,2， 王思蕲， 赵 垚

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中 723000)

兰科植物自古以来便被赋予了不同的寓意和象征，拥有着高贵的品质，散发着自然之美和人文之美[1]。作为种类最多、分布最广的有花植物之一，兰科植物的生态类型丰富，且多为珍稀濒危植物，药用、观赏价值较高[2]。

兰科植物资源再生及合理开发利用多采用种子共生萌发与非共生萌发，其中，非共生萌发应用更为广泛[2]。白及(Bletillastriata)[3]的非共生萌发研究表明，白及种胚膨大至突破种皮后形成原球茎，原球茎的顶端分化叶芽，基部生根形成幼苗[4]。千代兰(Ascocenda‘FuchsGold’)[5]、西藏虎头兰(Cymbidiumtracyanum)[6]、蝴蝶兰(Phalaenopsisaphrodite)[7]等植物种子非共生萌发的过程与白及相同。对建兰(C.ensifolium)[3]的非共生萌发研究中发现，其种胚形成原球茎后进行伸长生长，至根状茎阶段可持续增殖，根状茎继代培养形成芽后成苗[8]。墨兰(C.sinense)[9]、春兰(C.goeringii)[10]、寒兰(C.kanran)[11]、大花蕙兰(C.hybrid)[12]等兰科植物种子非共生萌发的过程与建兰的相同。兰科植物种子非共生萌发除白及和建兰的萌发成苗模式外，是否还存在与上述二者差异的形式，目前尚未见报道。

本课题组在对杜鹃兰(Cremastraappendiculata)种子非共生萌发研究中，发现其萌发过程与白及、建兰不同。本文通过对白及、杜鹃兰、建兰3种兰科植物非共生萌发成苗过程比较观察，展示3种兰科植物种子非共生萌发成苗的差异，为兰科植物非共生萌发研究提供参考。

1 试验

1.1 材料

非共生萌发培养材料：采集白及、建兰、杜鹃兰成熟未开裂蒴果分别置于广口瓶内，自来水冲洗3～4次后，置SW-CJ-2D双人单面垂直净化工作台上使用体积分数75%酒精和质量分数10%次氯酸钠溶液对蒴果消毒，无菌水冲洗3～4次，取出置于无菌培养皿内切除蒴果两端，划开侧面，用镊子夹取蒴果，将种子抖入无菌玻璃瓶内。晾干后存储于4 ℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

白及种子(2021年1月播种，2021年2月成苗，培养50 d)：1/2MS固体培养基；杜鹃兰种子(2020年10月播种，2021年4月成苗，培养6个月)：1/2MS+2 g/L水解酪蛋白+0.5 mg/L NAA液体培养基，培养至多数产生分支后移入配制相同的固体培养基内；建兰种子(2019年10月播种，2021年5月成苗，培养19个月)：种子萌发培养基为1/2MS固体培养基，根状茎分化培养基为1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA固体培养基。

培养温度(25±2)℃，光照时间12 h/d，静置培养。白及光照培养，光照2500～3000 lx；杜鹃兰弱光培养，光照500～1000 lx；建兰种子萌发前暗培养，萌发后(140 d)移至光下培养，光照2500～3000 lx。

1.2.2 观察记录

Nikon SMZ800体视显微镜定期观察白及、杜鹃兰、建兰种子的非共生萌发生长情况。观察白及时，未形成原球茎前可隔瓶身观察，形成原球茎后，需每次选20个样本挑出至培养皿后，在体视显微镜下观察；杜鹃兰与建兰在形成根状茎后，不同生长阶段各选20个样本挑出观察。图像采集使用Leica M205C体视显微镜。

2 结果观察

2.1 白及非共生萌发成苗

培养7 d，大多数种子种胚膨大，变绿，种胚突破种皮，形成原球茎(图1-A)，原球茎呈卵圆形，绿色均匀。培养15 d，原球茎顶端生长出叶片(图1-B)，基部形成簇状假根，均匀分布。培养约30 d，原球茎基部分化出不定根(图1-C)。培养50 d,形成三叶两根幼苗(图1-D)。

图1 白及非共生萌发成苗过程

2.2 杜鹃兰非共生萌发成苗

培养约20 d，种胚膨大至突破种皮(图2-A)。培养30 d，形成原球茎，出现假根。培养约60 d,形成根状茎(图2-B)，少数根状茎形成分支，一些呈绿色，顶端鳞片无色。根状茎生长过程中会弯曲，形成背腹面，假根在背面较多，腹面较少。培养约90 d，出现褐变，根状茎产生多级分支，次级分支顶端形成休眠芽(图2-C，上面箭头)。培养约130 d，根状茎顶端产生叶片。培养180 d，着生叶片的部位分化出根，形成幼苗(图2-D)。培养240 d，形成假鳞茎。杜鹃兰根状茎大多为水平生长，不伸入培养基内部。根状茎也存在不产生分支的情况，根状茎伸长，产生多枚鳞片后，顶端出现叶片分化成苗。

图2 杜鹃兰非共生萌发成苗过程

杜鹃兰种子非共生萌发过程与白及不同。白及非共生萌发成苗过程为种胚膨大至突破种皮，形成原球茎，原球茎上端形成叶片，随后形成根直接成苗。杜鹃兰原球茎形成后，伸长生长形成根状茎，顶端分化出叶芽，叶基部长出根发育成苗。白及非共生萌发各阶段整齐度高，杜鹃兰整齐度较低。

2.3 建兰非共生萌发成苗

种子在萌发培养基上培养约140 d，种胚膨大突破种皮，形成无色的原球茎(图3-A)。培养约250 d形成基部为绿色根状茎(图3-B)。根状茎持续分支，呈现明显向地性，顶端没有芽的分化，培养450 d形成大量鲜绿色分支(图3-C)。根状茎顶端呈锥状，具鳞片，下侧是大量簇状假根(图3-D)。当根状茎转移到分化培养基，培养60 d，根状茎顶端膨大，形成由数枚光滑覆瓦状鳞片包裹的芽(图3-E)。培养约120 d形成具有叶和根的幼苗(图3-F)。图3-E中箭头指示部位表示根状茎分化，图3-F中箭头指示根的位置。

图3 建兰非共生萌发成苗过程

杜鹃兰原球茎形成根状茎后仅进行有限分支即可分化成苗，分支期间会形成休眠芽且大多水平分布于培养基表面。建兰原球茎形成根状茎后，持续产生分支增殖，改变培养基激素后才可进入分化阶段，且其根状茎有明显向地性。

3 分析与讨论

大多数兰科植物的非共生萌发培养过程与白及相同，如千代兰(Ascocenda‘FuchsGold’)[5]、西藏虎头兰(C.tracyanum)[6]、扇形文心兰(Psygmorchispusilla)[13]、蝴蝶兰(Phalaenopsisaphrodite)[7]、铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)[14]、小叶兜兰(Paphiopedilumbarbigerum)[3]、卡特兰(Cattleyahybrida)[3]、大花君子兰(Cliviaminiata)[3]、金边龙舌兰(Agaveamericana‘Variegata’Nichols)[15]、树兰(EpidendreaeHumb)[16]、鹤望兰(Strelitziareginae)[17]等。3种成苗模式的兰科植物如图4所示。

图4 3种成苗模式的兰科植物

扇形文心兰种子非共生萌发种胚一端产生芽，随后产生多枚叶片，形成根(图4-A)[13]。蝴蝶兰原球茎顶端存在生长点，根由原球茎下部分化产生，且其原球茎增殖产生大量原球茎，或直接分化成苗(图4-B)[7,18]，故白及是绝大多数兰科植物种子萌发成苗的模式。

与建兰非共生萌发过程相同的兰科植物有墨兰(C.sinense)[9]、春兰(C.goeringii)[10]、寒兰(C.kanran)[11]、大花蕙兰(C.hybrid)[12]、蕙兰(C.faberi)[19]、莲瓣兰(C.tortisepalum)[20]等。墨兰根状茎持续增殖最合适的基本培养基是MS培养基(图4-C)[9]；寒兰根状茎在分化培养基中顶端分生组织分化出芽(图4-D)[11]。建兰类的成苗模式中存在根状茎持续增殖阶段，需改变培养基激素才能分化成苗。

与杜鹃兰相同的兰科植物有黄花火烧兰(Epipactisflava)[21]、多花指甲兰(Aeridesrosea)[22]、巨兰(Grammatophyllumspeciosum)[23]、山兰(Oreorchispatens)[24]、地宝兰(Geodorumdensiflorum)[25]等。E.flava的体外繁殖研究中展示了其成苗模式图，与杜鹃兰的相似，存在休眠芽，呈现显著顶端优势(图4-E)[21]；地宝兰根状茎水平生长，只进行有限分支后便可成苗(图4-F)[25]。杜鹃兰根状茎大多水平分布在培养基表面，但当培养基中萘乙酸浓度呈倍数高于6-BA浓度时，其根状茎也存在伸入培养基内部的情况，故激素可能会影响植物的形态发生。建兰持续增殖根状茎与分化根状茎，杜鹃兰根状茎上的休眠芽与继续生长的分支，除外部形态存在差别外，内部结构也可能存在差异，可制作石蜡切片观察。

兰科作为被子植物第三大科[2]，种子萌发过程可能存在更多类型。现有资料中还存在两种特别的类型：鬼兰(Dendrophylaxlindenii)种子发育成个体的过程没有叶的分化，光合作用器官为根(图5-A)[26]；天麻(Gastrodiaelata)种子萌发形成个体的过程没有根和叶的分化，植株只具茎和花(图5-B)[3]。图5-A中箭头指示为根[26]；图5-B中上侧箭头指示花序，下侧箭头指示块茎。二者种子萌发产生的个体形态与本文描述的3种模式存在差异，也可据此作为两种“成苗”模式，但广义的成苗过程包括叶与根的发生[27]，上述二者可能不符合广义的成苗模式。

图5 两种兰科植物

综上所述，本文将兰科植物种子离体培养成苗区分为3种模式(白及、杜鹃兰、建兰)，白及是绝大多数兰科种子萌发成苗的模式。在兰科植物的非共生萌发研究中，培养早期就可根据这3种成苗模式，确定该材料后续培养方案。另外，原球茎或根状茎的增殖有利于优良品种的高效工厂化生产和兰科植物快速繁殖技术的发展。白及模式的原球茎和杜鹃兰模式的根状茎增殖与芽分化均可同时进行，建兰模式根状茎的持续增殖特点可提供大量根状茎，分瓶转接至分化培养基上便可大规模生产幼苗。