双抗原夹心ELISA法检测登革病毒感染患者血清中的EDⅢ抗体

丁细霞，蔡建飘，温 坤，詹利利，宋嘉龄，陈满

据WHO统计，全球每年超过1亿人感染登革病毒，其中50万人发展成为登革出血热，死亡人数超过25 000人。随着全球气候变暖、国际旅游业和城市化等因素影响，登革热的发病率逐年上升。近年来我国登革热疫情越发严重，2002年、2006年和2014年在广东省分别出现登革热大流行，受感染人数已超45 171人[1-2]。而迄今为止，人类对登革热仍无特效治疗药物及安全有效疫苗[3]。临床实践证明早期诊断、及时临床救治可以有效减少登革热的病死率。我们前期利用登革病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体建立双抗体夹心抗原检测方法，该方法能区分4个血清型登革病毒感染，具有很好的特异性和敏感性[4]。并分析了登革病毒感染患者血清中的NS1抗原和抗体的动态过程，证实了联合抗原和抗体检测能够明显提高登革病毒感染的检出率[5]。为了获得一套完整的抗原、抗体检测方法，实现登革病毒感染的全程诊断。我们利用前期表达的EDⅢ蛋白建立一种双抗原夹心抗体检测方法，该方法与传统的间接法或抗体捕获法不同，利用两种抗原夹心来捕获血清中的抗体，具有更高灵敏度和特异度。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 酶联板(costar，Coming，美国)，TMB显色液(KPL，美国)，HRP(Sigma．Aldrich，美国)，RPMI 1640、MEM培养基和胎牛血清(GIBCO,美国)，SPF级雌性10-12周Balb/c小鼠购自南方医科大学实验动物中心，登革病毒核酸检测试剂盒购自广州达安基因股份有限公司，登革病毒NS1抗原检测试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司，登革病毒IgM抗体检测试剂盒(Panbio，澳洲)，其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 质粒、菌种、抗体和细胞株 4个血清型的DENV标准株和白蚊伊蚊C6/36细胞由广州市疾病预防控制中心惠赠。重组的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白为本实验室通过构建真核表达载体转化的酵母细胞表达并经镍柱纯化所获得，该蛋白经登革病毒免疫的动物血清证实具有良好的抗原性[6]。1-4型登革病毒EDⅢ蛋白特异性单抗隆抗体和西尼罗病毒NS1单克隆抗体为本实验室保存。登革病毒NS1抗原检测方法为本实验室前期建立。

1.3 血清标本 1-4型登革病毒EDⅢ蛋白分别免疫的小鼠血清、1-4型登革病毒EDⅢ蛋白混合后免疫的小鼠血清和1型登革病毒EDⅢ蛋白免疫的兔血清、AF-MP1免疫的小鼠血清和兔血清为本实验室前期免疫动物获得；184例健康人群血清标本来源于珠江医院健康人群体检血清，168例临床确诊的登革热患者血清标本(其中1型登革病毒感染患者血清167份，2型登革病毒感染患者血清1份)来源于2014年广州市登革热疫情暴发时珠江医院收集的门诊和住院登革热患者血清，所有血清标本均经PCR或者NS1抗原检测阳性。

1.4 HRP标记1-4型登革病毒EDⅢ蛋白及效价测定 采用改良的过碘酸钠法标记1-4型登革病毒EDⅢ蛋白。操作简述如下：称取4 mg辣根过氧化物酶搅拌溶解于1 mL蒸馏水中，加入0.1 mol/L过碘酸钠0.2 mL，室温避光反应30 min，用1 mmol/L pH4.4醋酸钠缓冲液于4 ℃透析去除多余的过碘酸钠，并用碳酸盐缓冲液(0.2 mol/L pH=9.5)调节pH值至9.0，并加入到 1 mg 经碳酸盐缓冲液(0.2 mol/L pH9.5)透析过的EDⅢ蛋白中，室温下避光反应2 h，最后加入100 μL 新配4 mg/mL硼氢化钠，4 ℃避光静置2 h后，用PBS于4 ℃避光透析，加入终浓度为50%的甘油-80 ℃保存备用。

并分别以10 μg/mL的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白特异性单抗隆抗体包被聚苯乙烯微孔板，并以抗西尼罗病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体为无关对照，分别加入梯度稀释的HRP标记的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白，以相同稀释度下抗登革病毒EDⅡ蛋白特异性抗体包被板条检测OD450值/无关对照OD450值(P/N值)≥2.1为该HRP标记蛋白的效价。

1.5 双抗原夹心ELISA法的建立 以1-4型登革病毒EDⅢ蛋白(按1∶1∶1∶1浓度比)为捕获抗原，HRP标记的4个血清型登革病毒EDⅢ蛋白(HRP-EDⅢ)为检测抗原用于建立双抗原夹心抗体检测方法。简述如下：将1-4型登革病毒EDⅢ蛋白(按1∶1∶1∶1比例混合后)分别按(0.05 μg/ mL，0.1 μg/ mL，0.2 μg/ mL，0.5 μg/ mL，0.8 μg/ mL，1 μg/ mL)6个不同蛋白浓度包被聚苯乙烯微孔板，4 ℃包被16 h后，用0.25%的酪蛋白封闭液4 ℃封闭24 h后，分别加入不同稀释度的EDⅢ蛋白免疫小鼠血清，并以曲霉AF-MP蛋白免疫小鼠的鼠血清为阴性对照，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板5次后，加入100 μL/孔不同稀释度(1∶200，1∶500，1∶1 000，1∶2 000)的HRP-EDⅢ蛋白，37 ℃孵育30 min，洗板8次后，加入100 μL/孔的TMB，室温避光显色10 min，1 mol/L H2SO4终止反应，测定A450值。

1.6 双抗原夹心检测方法的特异性和敏感性 利用所建立的双抗原夹心ELISA法分别检测1-4型登革病毒EDⅢ蛋白免疫的小鼠血清和1型登革病毒免疫的兔血清，以曲霉AF-MP蛋白免疫的小鼠血清[7]和兔血清为阴性对照，评价检测方法的敏感性和特异性。

1.7 双抗原夹心检测方法的临床应用 利用上述建立检测方法对184份珠江医院门诊健康体检者血清标本进行检测以确定检测方法的临界值。并以此为标准对临床确诊的168例登革热患者血清标本进行评估，同时与Panbio MAC ELISA试剂盒进行同步比较，并分析3种检测方法对不同时期登革热患者检测的敏感性。

1.8 登革病毒NS1抗原检测试剂盒检测临床标本 具体操作参见文献[4]，简述如下：抗登革病毒NS1单抗包被的酶联板，分别加入1∶10稀释的登革患者血清标本，并以健康体检血清标本为阴性对照，37 ℃孵育1 h，洗涤后加入1∶1 000稀释后的HRP-3B1A15，37 ℃孵育30 min，洗涤后加入TMB室温避光显色10 min，1 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪测定A450值。

1.9 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行McNemar's χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HRP标记EDⅢ蛋白的效价测定结果 以抗西尼罗病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体为无关对照，以1-4型登革病毒EDⅢ蛋白特异性单克隆抗体包被聚苯乙烯微孔板，经直接ELISA法检测HRP分别标记的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白效价(除2型为1∶16 000外)均在1∶512 000以上，说明HRP标记EDⅢ蛋白具有很好的效价，可用于作为双抗原夹心检测方法的检测抗原。

2.2 双抗原夹心ELISA法的建立 以不同浓度的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白混合物(浓度比例1∶1∶1∶1)包被聚苯乙烯微孔板，并以不同浓度的HRP标记EDⅢ蛋白为检测抗原，分别检测不同稀释度的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白免疫小鼠血清标本，并以曲霉AF-MP蛋白免疫小鼠血清为阴性对照。经方阵滴度法确定了捕获抗原的最佳包被浓度为1-4型登革病毒EDⅢ蛋白(浓度比例1∶1∶1∶1混合)0.2 μg/mL, 检测抗原的工作浓度为1∶1 000。

2.3 双抗原夹心ELISA法检测动物免疫血清的敏感性和特异性 利用所建立的双抗原夹心ELISA法同时检测梯度稀释的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白免疫小鼠血清和1型登革病毒EDⅢ蛋白免疫兔血清，并以曲霉AF-MP蛋白免疫小鼠和兔血清为阴性对照，结果如图1所示，本研究所建立检测方法对1-4型登革病毒EDⅢ蛋白免疫小鼠血清的检测限分别为：DENV1-EDⅢ和DENV4-EDⅢ为1∶3 200；DENV2-EDⅢ和DENV3-EDⅢ为1∶6 400；1-4型登革病毒EDⅢ蛋白混合免疫小鼠血清和DENV1-EDⅢ蛋白免疫兔血清检测限分别为1∶25 600和1∶51 200，而与曲霉AF-MP蛋白免疫小鼠和兔血清均无交叉反应。

2.5 双抗原夹心ELISA法与Panbio MAC ELISA试剂盒的比较 利用所建立的双抗原夹心ELISA方法和Panbio IgM抗体检测试剂盒分别对实验室确诊的168份登革病毒感染患者血清标本进行检测，并比较两个方法的敏感性。结果如表1所示，2种检测方法对168份确诊登革热患者血清标本检测的阳性率经McNemar分析，差异无统计学意义(P=1.000)。且吻合率为k=0.817，P=0.000，说明两种诊断方法的吻合率较高。

2.6 双抗原夹心和双抗体夹心联合检测登革病毒感染患者血清 为进一步评价本方法在不同发病时间段的检测价值以便于更好的指导临床应用，我们又平行分析了不同发病时间段患者血清中DENV1-NS1蛋白和抗EDⅢ抗体的检出率。结果表明，在发病第1～2 d时，NS1抗原检测的阳性率在94.1%～100%，而抗体完全检测不到；在发病3～8 d，NS1抗原的检出率为86.7%～100%，在发病第3 d，血清中抗EDⅢ抗体逐渐被检测出来，且随着发病时间的延长检出率逐渐增高，在发病第9 d时检出率可达100%；而两种检测方法同时检测时，标本检测的阳性率可以提升到94.1%～100%(表2)。

表1 双抗原夹心法与Panbio MAC ELISA检测结果的比较Tab.1 Sensitivity between double-antigen sandwich ELISA and Panbio MAC ELISA for sera from patients with DENV infection

图1 双抗原夹心ELISA法检测DENV-EDⅢ免疫动物血清的灵敏度Fig.1 Detection sensitivity of the double-antigen sandwich ELISA for anti-DENV-EDⅢ serum

表2 3种检测方法对不同发病时间登革病毒感染患者血清标本检测的灵敏性Tab.2 Sensitivity results of three assays in acute sera from patients with confirmed DENV-1 infection at different times

3 讨 论

我们在前期已经建立了一套能够同时检测到4个血清型登革病毒NS1抗原的检测方法[4]，该方法目前已与公司合作实现试剂盒的产业化并获得了医疗器械生产注册证。但我们前期的研究表明同时联合抗原和抗体检测方法能够更好地提高登革病毒感染的检出率[5]。针对这一特点及目前用于登革病毒抗体检测的商品化试剂盒大部分都是基于间接ELISA法或者IgM的捕获法，而这两种检测方法在临床应用中普遍认为特异性不好，尤其对于黄热病毒交替流行疫区的诊断带来诸多不便。而近年来研究表明，具有双重识别机制的双抗原夹心抗体检测方法明显比传统的IgM捕获法的敏感性和特异性提高了许多。鉴于此，为了提高检测方法的特异性，我们在成功表达获得4个血清型登革病毒EDIII蛋白基础上，利用4个血清型登革病毒EDIII蛋白混合包被作为捕获抗原，以HRP标记的4个血清型登革病毒EDIII蛋白作为检测抗原，建立双抗原夹心抗体捕获的ELISA检测方法，以期解决当前MAC-ELISA的特异性问题。

由于国内没有2、3和4型登革病毒流行，我们缺乏其他3个血清型登革病毒感染标本对方法学进行评估。因此，我们使用1-4型登革病毒EDIII蛋白分别免疫小鼠，以各个血清型EDIII蛋白免疫血清对检测方法的敏感性进行评估。本研究所建立检测方法能够同时检测到4个血清型登革病毒EDIII蛋白免疫小鼠血清和DENV1EDIII蛋白免疫兔血清，而与曲霉AF-MP蛋白免疫小鼠和兔血清均无交叉反应。此外，我们通过对184份健康体检者血清标本进行检测，并确定检测方法的临界值。本研究所建立的双抗原夹心检测方法与健康体检者血清标本均无交叉反应，特异度为100%(184/184)，在对168份确诊的登革热患者血清标本的检出率为57.1%(96/168)，而Panbio MAC ELISA试剂盒的检出率为57.7%(97/168)，2种检测方法结果差异无统计学意义P=1.000。推测检测的敏感性与标本采集的时间有关，本研究所采集的标本均为急性期标本，标本中抗体含量不高，导致这这两种检测方法的敏感性均不高。为进一步评价我们所建立检测方法的临床应用价值，我们利用前期研制的登革病毒NS1抗原检测试剂盒同时对该168份登革热患者血清标本进行平行检测，并分析2种检测方法在登革热诊断方面的价值。结果表明，抗原检测对于发病 7 d 以内标本检测的阳性率最高，而抗体检测方法对于发病 6 d 以内标本检测率不高，但对于发病 9 d 以上标本检出率可达100%。如同时联合抗原抗体两种方法进行检测，可以明显降低漏诊率，其检测的总阳性率可提高到97.6%，对于酶联检测，这完全满足临床诊断需求。

综上，为了进一步提高登革热临床诊断的准确性，本研究通过改变传统的IgM捕获法或间接法检测抗体，通过酵母系统表达出4个血清型登革病毒EDⅢ蛋白，并用于建立双抗原夹心抗体检测方法，该方法具有良好的特异性和敏感性，对发病 9 d 以后标本检测的阳性率高达100%。此外，研究发现联合本课题组前期建立的登革病毒NS1抗原检测方法可以明显提高检测的阳性率和检测时限，为登革热临床诊断提供重要依据。由于抗体的产生一般需要在发病 3～5 d 才开始出现，而本研究发病8 d 以上的临床标本极少，这也是本研究的不足，为进一步对该方法敏感性进行评价，后续我们将收集更多登革热恢复期患者血清标本对本文所建立的方法学做进一步评估。

利益冲突：无

引用本文格式：丁细霞，蔡建飘，温坤，等. 双抗原夹心ELISA法检测登革病毒感染患者血清中的EDⅢ抗体[J].中国人兽共患病学报，2022，38(4)：317-321. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.035