不同品种辣椒镉积累特性与生理抗性和镉亚细胞分布关系

2022-04-25刘贝贝范成五

西南农业学报 2022年3期

潘攀 ,刘贝贝,范成五,吴琳

(1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海口 571101；2.海南省热带生态循环农业重点实验室，海口 571101；3.国家农业环境儋州观测实验站，海南儋州 571737；4.贵州省土壤肥料研究所，贵阳 550006)

【研究意义】辣椒是广受人们喜爱的蔬菜之一，在我国种植面积居蔬菜作物第2位[1]，同时辣椒又是Cd高积累蔬菜[2]，据统计，重庆市主城区市售辣椒果实Cd含量范围为0.22～1.89 mg/kg，参照国家Cd食品卫生限量标准(≤0.05 mg/kg)，Cd超标率达57.3%[3]。因此，辣椒Cd污染问题不容忽视。贵州是辣椒种植大省，2019年统计数据显示，贵州辣椒种植面积占全国总种植面积的21.87%，产加销规模均居全国第一[4]。然而贵州地质高背景导致土壤Cd污染问题突出[5-6]，贵州碳酸盐岩发育土壤中Cd平均含量为1.76 mg/kg，石灰土中Cd异常富集，土壤Cd含量超标率高达78.3%。因此，贵州辣椒面临严重的Cd污染风险。Gan等[7]指出，利用作物不同品种对重金属吸收的差异，合理安排种植区域，是实现清洁农业生产和食品安全的有效策略。因此，明确贵州当地的辣椒品种对Cd的富集规律和耐性机制，可为辣椒种植合理布局提供科学依据，对减少或预防辣椒Cd污染、保障农产品安全生产具有重要意义。【前人研究进展】植物抗氧化机制和亚细胞水平响应规律是探讨植Cd耐性机制两个重要角度。当植物受到Cd胁迫时，植物会发生新陈代谢紊乱，这种紊乱表现包括植物体内活性氧动态平衡状态遭到破坏，原本抗氧化系统清除活性氧能力下降[8]。在一定浓度范围内的Cd可刺激植物产生应激反应，生成较多的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等酶促氧化剂，以及谷胱甘肽、类胡萝卜素等非酶促氧化剂，以清除更多的活性氧[9-10]；但超过一定浓度，植物体内活性氧自由净余量不断增加，最终也会毒害植物[11]。可溶性蛋白是植物体内重要的代谢物质，当植物受到重金属胁迫时，可提高植物功能蛋白数量，以维持细胞正常生理代谢活动，也可表现出变形、降解的现象[12]。植物亚细胞组织与Cd相互作用，进而影响到Cd的毒性：如细胞壁中的蛋白和多糖，与Cd发生配合沉淀作用，将Cd固持在细胞壁上[13]，可降低Cd对其他组织的毒害；而当Cd穿过细胞壁和细胞膜进入细胞质后，可以刺激植物螯合肽(PC)的形成，与Cd离子发生配合作用，将其转化为毒性较小的结合态，而Cd-PC螯合物多储存在液泡中，最终减少了Cd对细胞器的伤害[14]。【本研究切入点】贵州是辣椒种植大省，其产地面临着Cd污染风险，然而目前对当地辣椒品种Cd积累特性和耐性差异及机制研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】基于前期对贵州常种辣椒品种的初步鉴定结果，进一步针对其中Cd积累和耐性差异较大的品种S16和线椒301，进行不同浓度Cd胁迫试验，在对比分析两者对Cd积累特性差异的基础上，研究其生理生化响应和Cd亚细胞分布差异，探明不同Cd积累特性的辣椒品种的耐性机制，以期为当地辣椒种植合理布局及安全生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与处理

供试辣椒品种为S16(Cd低积累品种)和线椒301(Cd高积累品种)，种子由贵州省土壤肥料研究所提供。选择大小均匀、饱满一致的辣椒种子，用30%的次氯酸钠浸泡10 min后，用去离子水洗净，置于垫有湿润滤纸的培养皿中，并置于湿度为70%、温度为25 ℃的人工气候箱中进行培养。发芽3 d后，移入穴盘育苗，每穴播种2粒，培养至辣椒幼苗长出2～3片真叶备用。

1.2 水培试验设计

试验于2019年10—11月在中国热带农业科学院环境与植物保护研究所温室里进行。选择长势一致的壮苗，移栽至泡沫板上，并用海绵进行固定，置于2 L盛有无Cd霍格兰营养液的黑色塑料容器中进行预培养。营养液中各成分如下：500 mg/L Ca(NO3)2·2H2O, 810 mg/L KNO3, 500 mg/L MgSO4·7H2O, 155 mg/L NH4H2PO4, 20 mg/L EDTA-Fe, 3 mg/L H3BO3, 2 mg/L MnSO4·4H2O, 0.22 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.02 mg/L Na2MoO4, 0.05 mg/L CuSO4·5H2O, 用0.1 mol/L NaOH调节营养液的pH至6.0±0.1。经预培养7 d后，以优级纯CdCl2·2.5H2O的形式添加重金属Cd。本试验设置0、5和50 mg/L 3个浓度梯度，每个试验处理设3个重复，每盆(即一个重复)栽种6株辣椒幼苗，培养一个月，期间每3 d更换一次营养液，保持持续通气。

1.3 样品采集与指标测定

1.3.1 样品采集经溶液培养结束后，将辣椒幼苗从培养液中完整取出，用自来水和去离子水冲洗干净。随机选择3株鲜样，将根、茎、叶分开，用于生理生化指标和植株亚细胞Cd分布的测定；另外3株经烘干后用于生物量和各部位总Cd含量的测定。

1.3.2 生理生化指标测定分别称取0.5 g辣椒根、茎、叶，加入9 mL的提取液(0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.8)，匀浆后10 000 r/min离心10 min，取上清液用于可溶性蛋白(SP)、过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽(GSH)的测定。

可溶性蛋白(SP)采用考马斯亮蓝法测定：取0.1 mL上清液，加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合后放置2 min。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合形成青色物质，通过分光光度计(DR6000，美国HACH公司)测定595 nm处吸光度，计算蛋白质含量。

POD活性采用过氧化氢(CAT)测试盒(A084，南京建成生物公司)进行测定：取1 mL上清液，加入0.3 mL 20 mmol/L的愈创木酚(C7H8O2)溶液和0.2 mL 40 mmol/L的H2O2溶液，在37 ℃水浴反应30 min。POD将H2O2氧化生成茶褐色物质，通过分光光度计(DR6000，美国HACH公司)测定420 nm处吸光度，根据H2O2的消耗量计算POD活性。

GSH含量采用谷胱甘肽(MDA)测定试剂盒(A006，南京建成生物公司)进行测定：取1 mL上清液，加入3 mL反应液，反应液含0.5 mmol/L的乙二胺四乙酸，3 mmol/L的5,5二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和0.3 mmol/L的NADPH，在37 ℃下水浴1 min。GSH与DTNB反应生成黄色化学物，通过分光光度计(DR6000，美国HACH公司)在420 nm处测定吸光值，计算得到GSH的含量。

1.3.3 植株亚细胞Cd分布测定参照Weigel等[15]方法测定植株亚细胞Cd含量。称取0.5 g的根、茎、叶鲜样，加入15 mL 预冷的提取缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl( pH 7.5)， 250 mmol/L蔗糖和1 mmol/L的二硫赤鲜醇)进行研磨。研磨后的匀浆液在高速冷冻离心机(Centrifuge 5810R，德国Eppendorf公司)中3000 r/min离心15 min，下步沉淀为细胞壁组分(F1)，上清液又在15 000 r/min下离心30 min，分离出的下部沉淀为细胞器组分(F2)，上清液为可溶性组分组分(F3)。全部操作在4 ℃下进行，将上述3个组分用HNO3消解后，用石墨炉—原子吸收光谱仪(PinAAcle900T，美国Perkin Elmer公司)测定Cd含量。

1.3.4 植株各部位Cd含量测定将烘干后的辣椒幼苗根、茎、叶分别研磨，称取一定量的根、茎、叶部位的样品，加入5 mL HNO3于微波消解仪(Mars 6, 美国CEM公司)进行消解，消解液定容至50 mL，采用石墨炉—原子吸收光谱仪(PinAAcle900T，美国Perkin Elmer公司)测定Cd含量。使用植物标准物质GBW07603(GSV-2)作为质控样控制样品Cd回收率为(90±10)%。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2016对试验所得数据进行初步整理；应用SPSS 20.0 进行数据的独立样本t检验和单因素方差分析(LSD法)，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著；采用OriginPro 2016软件作图。

利用耐性指数(Tolerance index, TI)表征Cd胁迫下辣椒幼苗的生长响应，利用转运系数(Translocation factor)表征不同品种辣椒对Cd的转运特征。

TI=Cd处理辣椒生物量/对照处理辣椒生物量

TF=植株组织Cd含量/另一组织Cd含量

2 结果与分析

2.1 Cd胁迫对辣椒生长的影响

由图1可知，Cd对S16地上部和地下部生物量表现出“低促高抑”的现象，与对照相比，5 mg/L Cd处理下S16地上部和地下部生物量分别增加了17.4%和57.1%，而50 mg/L Cd处理下，其地上部和地下部生物量则下降了62.2%和39.7%。5和50 mg/L Cd处理均促进了线椒301的生长，5 mg/L Cd处理下地上部和地下部生物量比对照处理显著(P<0.05)增加了173%和158%，50 mg/L Cd处理下地下部生物量比对照处理显著(P<0.05)增加了229%。与对照相比，高浓度Cd胁迫下S16生长受阻，而线椒301仍表现为促进生长，表明S16对高浓度Cd胁迫更敏感。根据耐性指数可知(图2)，在5和50 mg/L Cd胁迫下线椒301的耐性指数均高于S16，随着Cd浓度的增加，2个辣椒品种的耐性指数均有所降低，在50 mg/L Cd处理下，S16的耐性指数为0.71，显著(P<0.05)低于线椒301品种(2.63)。综合生物量的变化特征及耐性指数分析，S16对高浓度Cd胁迫更敏感，线椒301对Cd的耐受程度更高。

不同字母表示同一辣椒品种的不同Cd浓度处理间差异显著(P<0.05)Different letters above the bars mean significant difference among treatments with different Cd concentrations (P<0.05)图1 不同浓度Cd胁迫下辣椒生物量Fig.1 The biomass of two pepper varieties under stress of different Cd concentrations

不同字母表示在相同Cd浓度处理下2个辣椒品种显著差异(P<0.05)Different letters above the bars mean significant difference between two pepper varieties under the treatment with same Cd concentration(P<0.05)图2 不同Cd浓度胁迫下辣椒的耐性指数Fig.2 The tolerance index of two pepper varieties under stress of different Cd concentrations

2.2 Cd胁迫对辣椒Cd吸收转运的影响

如表1所示，S16和线椒301 2个辣椒品种根部Cd含量在各部位中最高。当Cd浓度为5 mg/L时，S16茎的Cd含量显著(P<0.05)高于线椒301，但其叶中的Cd含量显著(P<0.05)低于线椒301；当Cd浓度为50 mg/L时，线椒301的根、茎、叶中Cd含量均显著(P<0.05)高于S16，分别是S16的4.9、1.9、1.7倍，表明线椒301在高浓度Cd胁迫时对Cd的吸收能力更强。

表1 不同浓度Cd处理下辣椒各部位Cd含量及转运系数

总体上，2个辣椒品种的TF根茎

2.3 Cd胁迫对辣椒可溶性蛋白、过氧化物酶活性和谷胱甘肽的影响

与对照相比，Cd胁迫下S16和线椒301根部和地上部的SP均有所增加，且2个品种根部的SP含量随Cd浓度的增加呈现先增加后降低的趋势(图3-a)，线椒301地上部SP含量随Cd浓度的增加而逐渐增加(图3-b)。具体变化情况为：5 mg/L Cd处理下，S16根部和地上部的SP较对照分别显著(P<0.05)增加了112%和146%，但50 mg/L Cd处理下，S16根部和地上部的SP与对照并无显著差异；在5和50 mg/L Cd处理下，线椒301根部的SP分别较对照显著(P<0.05)增加了220%和121%，其地上部的SP分别较对照显著(P<0.05)增加了336%和436%。表明Cd胁迫刺激了S16和线椒301 SP含量的增长，但高浓度Cd对S16的SP增长刺激效应减弱，对线椒301则保持持续刺激效应。

Cd胁迫导致S16和线椒301根部的过氧化物酶(POD)2个活性增加。在5 mg/L Cd处理下，S16根部POD活性较对照显著增加43%，但随Cd浓度增加(50 mg/L Cd)，其POD活性有所降低；在5和50 mg/L Cd处理下，线椒301根部的POD活性分别较对照显著(P<0.05)增加了80%和389%，随Cd浓度的增加而增加(图3-c)。在5和50 mg/L Cd处理下，S16地上部的POD活性分别较对照显著(P<0.05)增加了136%和494%，随Cd浓度的增加而增加，但线椒301地上部POD活性与对照相比无显著差异(图3-d)。品种根部和地上部POD活性对Cd胁迫的响应规律不同，表明不同部位对Cd胁迫也存在不一样的耐性机制。

S16和线椒301根部的谷胱甘肽(GSH)含量均随Cd浓度的增加而增加，5和50 mg/L Cd处理下，S16根部的GSH含量分别显著(P<0.05)增加221%和411%，线椒301根部GSH含量分别显著(P<0.05)增加145%和684%(图3-e)。随Cd浓度的增加，线椒301地上部的GSH含量呈增加的趋势，其中在50 mg/L Cd处理下，其GSH含量较对照显著(P<0.05)增加333%；S16地上部的GSH含量虽有所增加，但与对照相比无显著差异(图3-f)。

条形上方不同字母表示同一辣椒品种不同Cd浓度处理之间在0.05水平上差异显著Different letters above the bars mean significant difference among treatments with different Cd concentrations of the same pepper variety at 0.05 level图3 不同浓度Cd胁迫下辣椒地上和地下部可溶性蛋白含量(a,b)、过氧化物酶活性(c,d)和谷胱甘肽含量(e,f)Fig.3 The contents of soluble protein (a and b), peroxidase activity (c and d) and glutathione (e and f) in the root and aboveground parts of peppers under the stress of different Cd concentrations

上述结果表明高浓度Cd胁迫对线椒301根部和地上部的GSH增长有持续刺激效应，但仅对S16根部有持续刺激效应，对其地上部的刺激效应较弱。S16和线椒301的地上部GSH对Cd胁迫的响应规律存在一定差异。

2.4 Cd胁迫下辣椒Cd亚细胞分布规律

Cd在2种辣椒根茎叶部位的亚细胞水平上的分布规律总体相似：细胞壁>可溶性组分>细胞器。如表2所示，除了5 mg/L Cd处理下，茎的细胞壁Cd含量无显著差异外，其他亚细胞组分Cd含量均存在极显著的差异(P<0.01)，表明在亚细胞水平上，2个品种对Cd的富集特征差异十分显著。具体而言，2种Cd浓度胁迫下，根、叶的细胞壁和可溶性组分Cd含量均为线椒301>S16，茎、叶细胞器Cd含量均为S16>线椒301。

表2 不同Cd浓度处理下辣椒根、茎、叶的亚细胞组分Cd浓度

从Cd亚细胞组分的分配率分析来看，总体上，S16和线椒301各组织的细胞壁Cd含量所占比例最大，其次为可溶性组分和细胞器，说明辣椒幼苗吸收的大部分Cd被限制在细胞壁中。随着Cd浓度的增加，细胞壁中Cd含量比例均呈增加的趋势。相同Cd水平下，线椒301细胞壁Cd含量占比高于S16品种：5 mg/L Cd处理下，线椒301的根、茎、叶中细胞壁Cd含量占比分别比S16高25.5、7.8、14.3个百分点；50 mg/L Cd处理下，线椒301的根、茎、叶中细胞壁Cd含量占比分别比S16高26.6、9.6、7.3个百分点。表明线椒301各组织部位的细胞壁储存Cd的能力强于S16。

随Cd浓度的增加，S16和线椒301根的细胞器中Cd含量所占比例增加，表明Cd浓度的增加，对细胞器的胁迫程度增加。但S16根的细胞器中Cd含量占比高于线椒301，说明S16细胞器比线椒301的受到更大比例的Cd胁迫(图4-a)。在茎和叶组织中(图4-b，4-c)，线椒301细胞器的Cd含量占比均随Cd浓度增加而降低，而其细胞壁中的Cd含量占比增加，表明在Cd浓度增加的情况下，线椒301将多吸收的Cd更多地存于细胞壁中，从而相对减少了细胞器中Cd含量占比。然而，S16茎的细胞器中Cd含量占比随Cd处理浓度的增加而增加，说明S16将多吸收的Cd更多地存于细胞器中，如此更容易导致其细胞受损。

图4 不同辣椒品种根(a)、茎(b)、叶(c)的亚细胞组分Cd含量百分比Fig.4 The percentages of Cd in subcellular fractions of root(a), stem(b) and leaf(c) of different pepper varieties

3 讨论

镉是植物生长的非必需营养元素，但又极易被植物吸收利用[16]。耐性较强的品种可以在很大Cd浓度范围内保持正常生长，生物量呈持续增长趋势，而当Cd浓度超过一定水平时，敏感品种则表现出毒害效应，如生长迟缓、生物量下降等[17]。在本研究中，当Cd浓度为50 mg/L时，耐性较强的线椒301的生物量仍高于对照处理，而较敏感的S16品种在该浓度处理下生物量显著(P<0.05)低于对照，生长受到抑制。同一植物不同器官Cd积累能力存在较大差异，一般而言，新陈代谢旺盛的器官积累Cd较多[18]，Cd在植物各器官的分配规律一般为：根>茎叶>籽粒/果实，这在水稻[19]、玉米[20]、西芹[21]等作物中均得到证实。在本研究中，根也是辣椒幼苗蓄积Cd的主要器官，与前人研究结果一致。镉在植物各组织间的迁移转运决定了Cd积累特性和耐性大小[22]。高浓度Cd处理下，S16的TF根茎高于线椒301，茎更易受到Cd的胁迫，当超过其耐受程度，则会影响到生长发育；而线椒301则将更多的Cd蓄积在根部，确保了地上部组织的正常生长，这可能是其具有更强耐性的原因之一。但是，当Cd一旦转移到地上部，其在地上部组织间的迁移则会影响到可食部位Cd的积累，进而影响其食用安全性。低浓度Cd处理下，线椒301的TF茎叶显著高于S16，说明线椒301地上部Cd向上迁移的能力更强，加之其耐性强、Cd积累总量大，因此推测其可食部位富集Cd的风险更大，不建议种植在Cd污染严重的地块，但仍需盆栽或大田试验进一步验证。

可溶性蛋白(SP)作为重要的渗透调节物质，可指示功能蛋白数量，是植物抗性的重要指标[23]。Cd胁迫下，S16和线椒301的SP较对照有所增加，与刘朝荣等[24]研究发现珙桐幼苗在Cd胁迫时SP含量增加的结果一致。可溶性蛋白含量的升高，增加了细胞渗透浓度和功能蛋白的数量，有助于维持细胞正常代谢活动[12]。在根组织中，随着Cd浓度的增加，S16和线椒301的SP含量先增加后降低，但线椒301根的SP含量仍显著(P<0.05)高于对照；而在地上部中，线椒301的SP含量随Cd浓度的增加而增加，S16的SP含量则随Cd浓度的增加而呈先增加后降低的趋势，表明线椒301比S16有更强的细胞渗透调整能力，使其能在更高浓度Cd胁迫下正常生长。重金属胁迫导致植物产生较多的活性氧自由基，当活性氧积累到一定程度时，会对植物造成损伤[8]。为了防御重金属的氧化损伤，植物启动清除活性氧的保护系统。而过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽(GSH)是该保护系统的两种重要物质。在本研究中，线椒301根部和S16地上部的POD活性随Cd浓度的增加而增加，表明Cd激发了辣椒的抗氧化反应。但S16根的POD随Cd浓度增加表现为先增加后降低趋势，可能是高浓度Cd的胁迫降低了抗氧化系统的反应能力，这在鱼腥草[25]、高粱[26]等作物中也有相似的结论。谷胱甘肽(GSH)属于非酶促清除的抗氧化剂，是一类含巯基的低分子化合物[8]。一方面，GSH能直接清除植物体内的活性氧；另一方面，其含有的巯基可与Cd形成络合物而降低Cd的毒性[27]。在本研究中，随Cd浓度的增加，2个辣椒品种的根和地上部的GSH均随Cd浓度的增加而增加，而在高浓度处理下，线椒301的GSH的含量增加更显著，表现出其对Cd更强的耐性和解毒能力。

植物Cd亚细胞分布影响了Cd在植物体内的迁移转运[17]，对Cd亚细胞分布的研究是探讨不同品种对Cd积累和解毒机制差异的重要切入点。本研究的2个辣椒品种的Cd亚细胞组分的分布总体上表现为细胞壁>可溶性组分>细胞器，表明辣椒吸收的Cd主要储存在细胞壁中。但在闫磊等[28]的研究中，黄瓜幼苗亚细胞组分Cd分布情况是可溶性部分>细胞壁>细胞器，可能是不同作物种类导致的差异。细胞壁和可溶性部分在植物对抗Cd毒性过程中均发挥了重要作用。细胞壁是保护原生质体抵抗Cd毒性的第一道屏障[17]，其含有多糖类物质(如纤维素、半纤维素、果胶等)和Cd结合蛋白，能够将Cd固持在细胞壁中，减少其跨膜运输进入细胞内部[29-30]。可溶性组分主要包括细胞质和液泡，而液泡中含有大量的富硫态和有机酸，可与Cd结合区隔，从而降低其向其他部位的迁移转运[31]。对于本研究中的2种辣椒品种，根茎细胞壁Cd的占比最大，表明细胞壁对Cd的固持作用更为突出。细胞器是植物的核心部位，细胞器中Cd含量多少与细胞壁固持Cd能力和可溶性组分对Cd区隔化作用强度相关。当Cd浓度超过某一阈值，植物组织的细胞壁结构发生变化，导致其固持Cd能力下降，从而使更多的Cd进入到胞内，损伤细胞器[32]。S16茎叶的细胞器中Cd占比随Cd浓度的增加而增加，但线椒301茎叶的细胞器中Cd占比却随Cd浓度增加而降低，而细胞壁中Cd占比增加，其通过将Cd限制于细胞壁中而降低细胞器中Cd的占比，这也表明了线椒301细胞壁对Cd固持能力强，表现出对Cd更强的耐性。