甘肃省积石山县红细胞血型基因分布及精准输血中临床研究

罗强军 刘春霞 柴翠翠 林婧 张红良

摘要：目的：对甘肃省少数民族地区不同民族433例血液标本进行RH（C/c/E/e）、Lewis（Lw/Lw）、Duffy（Fy/Fy）等12种红细胞血型基因检测分析，为我省少数民族血液学研究、临床输血安全及稀有血型库建设等提供数据支撑，应用于精准输血医学。方法：对433例标本用荧光PCR法进行血型基因检测分析和统计，使血型基因分型应用于精准输血医学。结果：多数表型各民族间符合Hardy-Weinberg平衡法则（P>0.05），无统计学意义；CC、MN频率：回族>其他>汉族；Cc、Ee频率：汉族>其他>回族；Kell、Colton、Dombrock、Yt血型系统中，罕见表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+均为：其他>回族>汉族，且汉族中未发现Coa+b+、Yta+b+两种表型，经过χ2值运算民族之间具有统计学意义（P<0.05）。结论：甘肃省少数民族地区人群RHCE、MNS、Duffy、Kidd、Diego和Dombrock血型系统抗原基因频率呈多态性分布，Lw、Scianna、Kell、Colton、Yt和Lutheran血型系统呈单态性分布，罕见表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+民族之间存在着差异（P<0.05），有统计学意义。

关键词：红细胞血型；血型抗原；血型基因；基因分型；RhEC；精准输血

中图分类号：R55文献标志码：A

血型是分布在红细胞膜上的特异性抗原，是人类的重要遗传标志，具有遗传多态性，在临床输血安全性中发挥着决定性作用。1900年ABO血型的发现开创了免疫血液学（Immunohematolgy），开启了输血医学先河；随着分子生物学技术发展，血型检测已进入了后基因组时代，即血型基因组学（Blood group genomics）[1]。截至2021年2月，国际输血协会（International Society Blood Transfusion ISBT）发现并命名的红细胞血型系统有43个，共343个抗原，部分红细胞血型抗原在人群中的分布频率小于1%，稀有血型患者存在巨大的生存危机，即当需要输血治疗时不易找到相容的血液，当找不到相容血液时，可能会引发溶血性输血反应或新生儿溶血病等，出现溶血、孕妇早产等症状，严重者导致患者死亡。对人群进行血型筛查，特别是部分少数民族，其可能具有独特的遗传特征，在少数民族地区建立红细胞稀有血型数据库，为临床选择配合型血液输注提供依据，同时可以有效避免上述情况的发生。红细胞血型基因多态性的研究在精准输血医学（Precision transfusion medicine）中扮演着重要角色[2-3]。国内对少数民族人群稀有血型研究甚少，其可能具有独特遗传特征，为探讨少数民族人群红细胞的RhCE、Lw、Duffy、Kidd、MNS、Scianna、Colton、Dombrock、Kell、Diego、Yt和Lutheran血型系统基因频率分布情况，本研究采用荧光PCR技术对433例甘肃省少数民族地区人群血型基因进行检测分析，调查自治区人群12个稀有血型系统抗原基因频率及表现型频率的分布特点，为红细胞稀有血型库建设等方面提供一定的数据支持，同时为该少数民族人群制定个体化的输血治疗方案提供依据，并提高输血的安全性和精确性。

1对象和方法

1.1研究对象

收集2017年5月至2019年6月甘肃省临夏回族自治州积石山保安族东乡族撒拉族自治县人群标本433例，其中回族195例，汉族149例，其他89例（包括东乡族71例，撒拉族7例，藏族5例，保安族4例，土族1例，布依族1例），采用EDTA抗凝真空管采集标本2～3 mL，进行血型基因检测，原始数据及检测记录完整。本研究已征得兰州大学第一医院伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂

血型基因检测、DNA提取等实验所需试剂盒：人类红细胞稀有血型基因分型检测试剂盒（江苏中济万泰生物医药有限公司，批号20180819）；荧光PCR仪（德必基生物科技（厦门）有限公司，型号TBG一Q6000，DNA提取试剂盒厂家TBG，批号C011712R0）；医用低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，Mini一10K）；台1式冷冻离心机（久保田公司，S700TR）；紫外分光光训度计（Merinton，SMA4000）；核酸纯化仪（杭州博日科技有限公司，NPA32P）；漩涡混匀器（金坛区白塔新宝仪器厂，XH-T）。

1.3检测方法

对32种临床重要的红细胞抗原基因设计专一性引物，结合SYBR Green I进行实时荧光PCR扩增及熔解曲线反应，详细见图1，当引物序列与待测序列互补时，通过PCR反应将目的片段复制与放大，再通过熔解曲线的荧光信号与溫度变化，检测特异性产物在双链解离50%时的温度（Tm）。PCR体系中加入内参（IC），用于评估样本质量及PCR抑制因素。按照人类红细胞稀有血型基因分型试剂盒（荧光PCR法）（江苏中济万泰生物医药有限公司）的说明书操作步骤进行基因分型。首先配制反应液，加入PCR浓缩液管中，与工作液混匀。每孔加样10μL，封膜后置入96孔板进行PCR扩增和荧光检测。以荧光PCR软件开启数据，利用阳性、阴性的Tm判断值范围找出阳性的孔。结合型别判读表，直接判读阳性阴性结果1。

1.4统计分析

采用SPSS22.0统计学软件进行统计学分析。结果以频率、构成比指标表达，计量资料以3组间比较采用t检验，多组比较采用方差分析，以P<0.05表明具有显著性差异并且有统计学意义

2结果

（1）该地区RHCE、MNS、Duffy、Kidd、Diego和Dom？ brock血型系统抗原基因频率呈多态性分布，Lw、Scian？ na、Kell、Colton、Yt和Lutheran血型系统呈单态性分布。

甘肃省临夏回族自治州积石山保安族东乡族撒拉族自治县人群进行12种血型系统基因检测，433例标本中等位基因频率分布为：C=0.7875，c=0.6097，E= 0.4919，e=0.9053，Lwa=0.9977，Lwb=0，Fya=0.9954，Fyb= 0.1963，Jka=0.7344，Jkb=0.7783，M=0.7344，N=0.6074，S= 0.097，s=0.9053，Mur=0.0116，SC（-1，p2）=0，Dia=0.06，Dib=1.0000，Wra=0.0046，Wrb=0.8614，K=0，k=0.9977，Kpa=0.0323，Kpb=1.0000，Coa=1.0000，Cob=0.0092，Doa= 0.254，Dob=0.9815，Lua=0.2009，Lub=1.0000，Yta=1.0000，Ytb=0.023；其中等位基因频率分布状况，RHCE、MNS、Duffy、Kidd、Diego和Dombrock血型系統抗原基因频率呈多态性分布，Lw、Scianna、Kell、Colton、Yt和Lutheran血型系统呈单态性分布。其中等位基因c频率分布：汉族>其他>回族；等位基因N频率分布：其他>汉族>回族；等位基因Kpa、Coa、Cob、Doa均为其他>回族>汉族，且汉族中未发现等位基因Cob；c、N、Kpa、Coa、Cob、Doa等位基因的频率在汉族和少数民族之间存在一定的差异，且均为P<0.05，具有统计学意义。等位基因Lwb、SC（-1，p2）、K频率各民族均为0，等位基因Cob汉族中也未检测到，等位基因Dib、Kpb、Coa、Lub、Yta频率各民族均为100%，除以上七种外其他的等位基因在各民族之间差异符合Hardy-Weinberg平衡法则（P>0，05），无统计学意义。见表1所列。

（2）该地区罕见血型表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+民族之间存在着差异。

通过对甘肃省临夏回族自治州积石山保安族东乡族撒拉族自治县人群12种稀有血型系统抗原基因40种表型频率分布的Hary-Weinberg吻合度检验，其中29种表型各民族间符合Hardy-Weinberg平衡法则（P>0，05），无统计学意义。CC、MN频率：回族>其他>汉族；Cc、Ee频率：汉族>其他>回族；Kell、Colton、Dombrock、Yt血型系统中，罕见表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+均为：其他>回族>汉族，且汉族中未发现Coa+b+、Yta+b+两种表型，经过χ2值运算这几种表型均为P<0.05，民族之间存在着差异，均有统计学意义，可能由于少数民族起源、居住环境相对隔离、宗教信仰、通婚习俗及人群迁徙等因素的影响，使得部分血型表型具有自身的遗传特征，这对人类遗传学的研究具有重要的意义。具体数据见表2所列。

3讨论

本研究通过对甘肃省少数民族地区人群12种稀有血型系统抗原基因分布频率进行χ2检验，多数血型系统符合Hardy-Weinberg平衡法则（P>0.05），其中抗原C、c、E、e的抗原阳性频率分别为：78.75%、60.97%、49.19%、90.53%（表3），这与丁佳栋[4]“兰州地区献血员Rh血型抗原及RhCE基因分布”结果类似，但对于部分罕见抗原如：S、Kpa、Cob、Lua的抗原频率分布在民族之间存在差异，少数民族抗原阳性比例明显高于汉族，且之间的差异具有统计学意义（P<0.05）。抗原基因频率分布分析发现：RHCE、MNS、Duffy、Kidd、Diego和Dom？ brock血型系统基因频率呈多态性分布；Lewis、Scianna、Kell、Colton、Yt和Lutheran血型系统呈单态性分布；Kell、Colton、Yt血型系统中，罕见表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+中，少数民族均高于汉族（表4），且汉族中未发现Coa+b+（χ2=7.572，P=0.023）和Yta+b+（χ2=7.709，P=0.021）两种表型，经过χ2值运算这几种表型均为P<0.05，有统计学意义。

甘肃省临夏回族自治州积石山保安族东乡族撒拉族自治县是甘肃省唯一的多民族自治县，居住环境相对隔离，民族间有各自独立的宗教信仰与通婚习俗，具有自身的遗传特征，特别是少数民族中罕见表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+占比均高于汉族，说明汉族血型基因有着高度集中性，更接近于亚裔黄种人基因分布特征，因而血型系统基因遗传相对稳定[5-7]，其与国内的其他地区少数民族相比较也存在差异，因此不同地区、民族和人群中存在着一定的相同性和差异性[8-13]。这对人类遗传学的研究具有重要的意义。

人类红细胞血型的表型和基因型在遗传学上存在个体差异，各民族之间也有一定的差异性，由于血型分布与人种以及种族群体相关，此次研究对于甘肃省少数民族地区人群红细胞血型遗传背景及甘肃省稀有血型数据库的建设提供依据不同的血型抗原具有遗传多态性，不同民族或地区间具有一定的差异性。[14]输血可以挽救患者生命，但输血治疗引起的同种异体免疫反应也会威胁患者的生命安全。[8]在患者随机输血或妊娠免疫刺激时，一些稀有血型抗原不一定完全匹配，可能会从产生抗体，导致输血不良反应，新生儿溶血病和免疫性疾病。[11]精准医学的基本概念是考虑到个体差异后所实施的预防诊断和治疗策略，对有输血史、妊娠、组织器官移植等同种免疫作用产生血型抗体患者的输血（如常见的有抗E、抗C/c、抗EC、抗S/s、抗M/N、抗K、抗Mur、抗Fy等），甚至还发现由抗-Fy、抗k，抗C联合抗体[15-17]，给输血带来极困扰，需要个体化处理，输注相应抗原阴性的血液[14]。因此，调查地区性人群多种红细胞血型系统基因频率分布特点，建血型基因型数据库[18]，为患者提供与大多数免疫性抗原相容的血液成分，对稀有血型患者选择配合型血液输注、指导临床科学合理用血、提高血液资源有效利用，及预防新生儿溶血具有重要意义，且能达到精准输血的目的[19]。

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