一种基于全自动多重裂解滤膜法的研究应用

王传海 李湘秦 王伟妮 尹路 罗深恒

1. 广东省深圳市公安局 2. 广州高盛智造科技有限公司

引言

随着司法体系的不断完善及对违法行为打击力度的加强，我国性侵类案件占比呈逐年下降趋势，但每年仍有超过10000宗的案件量产生。在性侵类案件中，混合斑是最常见同时也是极为重要的物证类型。经过不断发展，混合斑中精子细胞DNA的分离提取技术趋于成熟[1]。目前主流的分离提纯方法有差异裂解法和滤膜法，此外还有免疫磁珠法[2,3]、细胞分选法[4,5]等技术。其中，差异裂解法主要根据精子细胞膜及细胞核表面含硫醇蛋白的特殊性，使用不同成分的裂解液进行两步裂解，去除女性成分后进行精子细胞的回收及提取[6]；而滤膜法则是根据精子细胞与其他细胞尺寸上的差异，使用特定孔径的消化纤维素或尼龙滤膜将精子细胞与其他细胞分离。前者耗时长，常需要过夜处理样本，且回收率低。滤膜法成本低、耗时短，对单细胞状态的样本效果优异，但对于精子细胞出现聚集的样本则效果不佳。为了缩短混合斑样品的处理时间，并使其更加符合法医物证领域自动化趋势，结合差异裂解法及滤膜法，开发出全自动多重裂解滤膜法。该方法首先在滤膜柱中进行两次裂解，充分去除女性成分，精子细胞则被截留在经优化筛选的专用滤膜上，经深度裂解后释放DNA，然后通过磁珠法进行提取纯化。此外，该方法在微量DNA自动提取工作站上实现了全自动化工艺并得到了实际应用验证，可在180min内同时完成24个混合斑样本的分离提纯。

一、材料与方法

（一）材料

收集12例来自实验室日常受理的性侵类案件检材，类型包括安全套、阴道拭子以及其它相关检材等，进行方法的开发及优化测试。统计实际应用案件检材223例，样本进行PSA检测，选取阳性检材进行检出率统计；样本类型包括安全套、阴道拭子、纸巾、内裤、床单及其他纺织品等。

（二）样品分离提纯

1. 手工分离提纯方法

（1）取适量检材，用PSA胶体金试剂条对样本进行预实验检测；

（2）将适量检材放置于上层管内，先用裂解液A于56℃震荡孵育15min，离心后收集液体，可用于女性成分STR分析；上层管中加入清洗液清洗1次，离心后加入裂解液B于56℃震荡孵育15min，离心后再清洗一次，此时精子细胞仍保留在上层管内（如图1A所示）；

（3）上层管中加入裂解液C，56℃震荡孵育30min，离心得含精细胞DNA的裂解产物；

（4）裂解产物依据TraceMag微量DNA磁珠纯化试剂盒（型号：TM-MU-K50）使用说明书进行提取纯化。

2. 自动化分离提纯方法

多重裂解滤膜法的自动化工艺在U-PURE 48微量DNA自动提取工作站基础上进行改造优化，最终整合升级为全自动精斑分离系统，该系统可兼容混合斑样本的分离提取（24通量）及普通案件检材的提取纯化（48通量）。进行混合斑分离提纯时，将检材放置于专用裂解板内，按指示（如图1B所示）摆放好配套试剂耗材（型号：TM-SPK24）后，选择相应程序，即可自动完成混合斑的分离提纯操作。

（三）STR扩增及电泳分析

STR扩增试剂盒为PowerPlex 21 System试剂盒，使用ProflexTMPCR仪进行扩增，DNA模板为luL，扩增体系与扩增参数参照PowerPlex 21 System试剂盒操作手册。扩增产物使用3500XL测序仪进行电泳分析，最终使用GeneMapper ID-X软件进行统计，获得样品STR图谱。

二、结果

（一）方法开发

通过显微镜观察阴道上皮细胞消化程度，本研究发现在56℃条件下，采用裂解并清洗2次，每次15min的裂解方式可最大程度消化阴道上皮细胞或仅残留少量无核的完全角化的阴道上皮细胞。同时裂解液中还加入了DNA消化酶，可以进一步去除女性成分，提高分离效率。而截留精细胞的滤膜孔径大小，则影响混合斑提取的灵敏度。本研究采用模拟混合精斑样本（正常人一次射精的精子浓度约1500万/mL，稀释至100个/μl，取约500个精子细胞与500μl TNS混合后56℃处理30min，加入到离心滤管4500rpm离心5min，再加入500μl TNE清洗 3次后正常裂解），进行荧光定量PCR 后获得孔径分别为10μm、5μm、2μm以及1μm的滤膜对精子的截留率。经测试，当选取孔径为2μm滤膜的离心套管时，可获得对精细胞的最大截留效果，平均可达93.26%（见表1）。当滤膜孔径为1μm时，虽然对精细胞的截留率与2μm滤膜接近（见表1），但因孔径过小容易导致堵塞，影响分离提纯。因此综合考虑，最终选取孔径为2μ m的滤膜，满足有效截留精细胞要求的同时还可兼容各种不同类型的案件检材，防止杂质堵塞或漏入下层管。

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（二）方法验证

选取保存良好的12例PSA检测呈阳性且已知STR检测结果的性侵类案件检材，类型包括安全套、阴道拭子、纸巾等，分别用常规差异裂解法及多重裂解滤膜法进行手工提取，通过比对测试结果对新方法进行验证。如表2及图2所示，对于不同类型案件检材，多重裂解滤膜法普遍可以得到更多的位点以及更高的峰值，各位点最高峰值平均高于常规裂解法30%~50%左右。如图3所示，得益于多重裂解滤膜法兼顾灵敏度及提纯效果的特殊体系，各STR位点峰值之间的均衡性更优于常规差异裂解法。尤其对于含精子量较少或陈旧的样本，多重裂解滤膜法效果更佳（图2 样本2/8/9；图3a/c/e）。

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（三）应用统计

全自动多重裂解滤膜法工艺建立后，在若干公安单位建立了应用示范点。截至2021年4月，总计检测了223份性侵案件检材，全部进行PSA胶体金检测，并选择阳性样本进行统计，总共得到98份阳性检材（详见表3）。其中，83份样本检出STR位点数（丢失位点数≤3），平均检出率高达84.7%。对样本进行分类后，统计出该方法对阴道拭子样本检出率高达92.6%，斑迹擦拭物样本检出率为72.7%，避孕套样本的检出率为85%，内裤样本检出率为100%，包括纸巾、床单、衣物等在内的其它样本检出率平均可达83.1%。结果表明，全自动多重裂解滤膜法工艺适用于多种类型的性侵类案件检材，包括常见的阴道拭子、避孕套、内裤及其它织物等，普遍具有较高的检出率。

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三、讨论

混合斑的处理方法不断得到改进和完善[7,8]，但相比其他技术，差异裂解法仍是目前最常用的混合斑处理方法。该方法耗时极长效率低下，虽经韩海军[9]、 张子阳[10]等的改良优化后，第一步裂解时间仍超过2小时。对于微量或陈旧的样本，长时间的裂解可能造成精子细胞DNA的损失或降解。相比之下，滤膜法耗时少且回收率较高，有利于快速办案。但在实际应用中发现，混合斑检材中的细胞常因死亡或外界环境的影响而发生聚团，导致滤膜法无法有效对精细胞进行分离，降低了检出率。在此基础上，多重裂解滤膜法同时兼具了两者的优点。经验证，在56℃条件下，在专用上层管中对混合斑样本进行多次（2次）短时（15min）裂解及清洗操作，即可有效去除女性阴道上皮细胞。同时，精子细胞则被孔径2μm的消化纤维素膜截留在上层管内，等待最终的深度裂解及DNA提纯。此外，相比其它具有自动化潜质的混合斑分离技术[11,12,13]，多重裂解滤膜法更易于实现自动化操作。

目前，自动化多重裂解滤膜法已在多个公安单位得到应用。结果显示，该方法对于常见性侵类案件检材的平均检出率高达84.7%，对于常见的检材，如阴道拭子、内裤、避孕套等具有优异的效果。对结果进行整理时，优先选取了PSA胶体金测试呈阳性的样本进行统计分析。对于PSA阳性但不能检出男性分型的样品，推测有如下原因：（1）采集样本时带入了前列腺抗原但未剪取或擦拭到精子细胞；（2）样本中精子数量稀少，有免疫反应但无法有效提取精子DNA，例如先天性少精或无精的男性；（3）PSA呈弱阳性结果可能为假阳性[14]。

另外，对部分PSA阴性样本进行分离提纯时，也会有一定比例出现完整男性分型。经分析，推测有如下可能性：（1）样本暴露时间较长，前列腺抗原受条件影响降解，但精子细胞仍有留存；（2）检测时未剪取或擦拭到前列腺抗原，但分离提纯时有精细胞存在；（3）因样本中抗原量少导致的PSA检测假阴性[15]。当样本中存在大量女性上皮细胞甚至微小组织块，或者细胞因死亡等因素形成大量聚团时，仍有可能出现因消化不充分导致的混合分型结果，对于此种情况，可先根据镜检结果进行评估，对提取纯化流程进行微调，比如增加裂解次数或时间等，以达到最优检测结果。