p16联合免疫组化标志物在妊娠期持续高级别宫颈鳞状上皮内病变中的诊断价值 *

刘艳娇，李淑红，白利颖，曹冬焱，杨佳欣，沈 铿，孙恒子**

(1.首都医科大学附属北京朝阳医院妇产科，北京 100020；2.中国医学科学院 北京协和医院妇产科，北京 100730)

近年来，随着三孩政策开放及筛查手段的提高，妊娠合并宫颈病变也被更多的发现并引起更多的关注。根据我国《妊娠合并子宫颈癌管理的专家共识》[1]，当细胞学为意义不明的非典型鳞状细胞(atypical squamous cells of undetermined significance,ASC-US)且高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)检测阳性者低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL),不典型鳞状细胞倾向上皮内高度病变(atypical squamous cells not except high lesion,ASC-H)及高级别鳞状上皮内瘤变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)及以上病变者应转诊阴道镜检查，根据检查情况行宫颈活检。然而，约48%～86%的妊娠期宫颈鳞状上皮内病变能自然消退[2-3]。子宫颈癌筛查的研究显示，联合检测有效提高了宫颈癌筛查的有效性，但仍有超过60%的患者转诊阴道镜检查，但病理结果提示组织学LSIL及以下[4]。孕期反复阴道镜检查可能增加患者的焦虑和担忧，降低患者的依从性[5]。因此，探索更多的妊娠期持续组织学HSIL高危标志物，以提高诊断的准确性并降低阴道镜转诊率是妊娠期宫颈癌防治工作中亟待解决的问题之一。

近年来，细胞学p16/Ki-67双染被提议作为阴道镜分流的生物标志物。然而，Ciavattini等[6]研究认为，妊娠期特殊的激素水平和生理环境可干扰参与细胞周期调控的蛋白表达，导致p16/Ki67染色阳性与宫颈病变的相关性差于非妊娠期，影响结果的判定。p16/Ki67染色在妊娠期宫颈病变中的应用价值尚需更多循证学依据。我们既往研究显示，p16联合细胞形态及HPV感染相关标记物SMAD3、YAP1、RELA高表达检出组织学HSIL较p16/Ki-67具有更高的灵敏度和特异性，提示p16与SMAD3、YAP1、RELA可能与宫颈上皮内病变进展密切相关[7]。本研究拟评估p16、Ki-67与细胞形态及HPV感染相关基因SMAD3、YAP1、RELA的表达与妊娠期宫颈病变转归的相关性，探索妊娠期持续组织学HSIL相关高危标志物，以期为妊娠期宫颈病变患者提供更精准的临床诊疗方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年1月至2020年1月于首都医科大学附属北京朝阳医院及中国医学科学院北京协和医院确认妊娠并定期产检的患者。严格筛选妊娠建档后行细胞学及HPV检查，纳入检查结果异常转诊阴道镜并行宫颈活检的患者作为研究对象。纳入标准：(1)妊娠前从未行HPV及TCT检查或妊娠前末次检查(1年以上)结果无异常；(2)孕期产检TCT异常和(或)高危型HPV阳性；(3)孕期阴道镜检查可疑，签署知情同意书后行宫颈活检病理检查。排除标准：(1)合并免疫缺陷、严重肝肾功能异常、严重全身系统性疾病者；(2)任何原因于妊娠28周前终止妊娠者；(3)宫颈病变筛查与宫颈活检间隔超过6个月；(4)宫颈活检组织不足，无法完成后续研究要求者。收集患者的一般资料、孕产次、TCT及HPV结果、阴道镜病理等结果。排除标准：(1)合并免疫缺陷、严重肝肾功能异常、严重全身系统性疾病者；(2)任何原因于妊娠28周前终止妊娠者；(3)宫颈病变筛查与宫颈活检间隔超过6个月；(4)宫颈活检组织不足，无法完成后续研究要求者。

1.2 研究方法 复核入组患者阴道镜病理后取活检病理蜡块切片4μm，梯度二甲苯脱蜡及乙醇水洗，冲洗切片3次。将洗后切片置于pH 9.0的EDTA中，置微波炉中加热至沸腾，冷却5min，重复4次，修复完毕后冷却至室温。3%过氧化氢液，37℃孵育10min。冲洗切片3次。滴加山羊血清封闭液，37℃湿盒中孵育10min，吸水纸吸干。滴加稀释后一抗，4℃孵育过夜，冲洗切片3次。37℃湿盒孵育1h。冲洗切片3次。孵育二抗30min。冲洗切片3次。滴加DAB显色液，蒸馏水冲洗。苏木素复染60s，蒸馏水冲洗。盐酸酒精分化2s，蒸馏水冲洗。脱水，透明及中性树脂封片。研究中抗体均购自美国Abcam公司。一抗的浓度：p16(1∶1000)、Ki-67(1∶1000)、SMAD3(1∶2000)、YAP1(1∶1000)和RELA(1∶2000)。PBS溶液为阴性对照。

1.3 结果判读 根据LAST中HPV相关病变的标准化方案(The Lower Anogenital Squamous Terminology Standardization project for HPV-associated lesions)[8]，p16阳性染色被定义为基底细胞层的持续强核或核+细胞质染色，向上延伸至少涉及三分之一上皮层。其他染色类型如仅细胞质、斑点状、水坑状、散在或单细胞阳性为阴性染色。Ki-67、SMAD3、YAP1和RELA阳性染色判定[7]：选择5个随机显微镜视野来评估半定量染色。免疫组化染色强度:+，弱(1分)；++，中等(2分)；+++，强(3分)。每个视野中阳性鳞状上皮细胞面积:+，0%～33%(1分)；++，33%～66%(2分)；+++，66%～100%(3分)。将免疫组化染色强度得分及染色阳性面积得分2个分数乘积后再乘以常数5得到5到45之间的染色总评分。0～17分：低表达(-)，18～45分：高表达(+)。对于阳性细胞的数量没有明确的定量标准。判读由两位病理科医师独立进行，判读结果不一致时由第三位病理科医师判读。

1.4 随访 收集患者产后6～12周复查TCT及HPV结果，异常结果行阴道镜活检者，追访患者活检病理结果。

1.5 统计学分析 采用SPSS 25.0软件，分子标记物表达与宫颈病变之间的相关性采用卡方检验(Fisher精确检验)。采用敏感度、特异度、约登指数和ROC曲线下面积(Area Under Curve,AUC)等指标评价诊断试验效能。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 入组患者一般资料 患者年龄为21～42岁，中位年龄为33岁。患者产前TCT结果：ASCUS合并高危HPV阳性患者28例，LSIL患者44例，ASC-H患者8例，HSIL患者42例。阴道镜活检病理为组织学LSIL及以下病变者共60例，其中包括宫颈良性病变24例，宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ 36例；组织学HSIL病变共62例，其中包括CINⅡ 42例，CINⅢ 19例以及原位癌1例。见表1。

表1 入组患者孕期联合筛查及活检病理结果

2.2 相关分子标志物在不同宫颈病变中的表达 免疫组化结果显示，62例组织学HSIL中，p16高表达(p16+)共42例，Ki-67高表达(Ki-67+)共30例，SMAD3高表达(SMAD3+)共24例，YAP1高表达(YAP1+)共27例，RELA高表达(RELA+)共38例；60例组织学LSIL中，p16+共14例，Ki-67+共11例，SMAD3+共17例，YAP1+共9例，RELA+共12例。组织学HSIL中p16(P<0.001)、Ki-67(P=0.004)、YAP1(P<0.001)和RELA(P<0.001)表达均明显高于组织学LSIL及以下病变；SMAD3在不同病变的表达无明显差异(P=0.225)。见图1。

2.3 联合分子标志物诊断产后高级别上皮内病变的效能评价 产后6～12周内共109例患者再次行联合筛查，其中86例患者再次行阴道镜检查活检，病理结果为组织学HSIL病变为45例，其中CINⅡ 33例(5例由孕期组织学LSIL进展为CINⅡ，9例由孕期组织学CINⅢ消退为CINⅡ，16例孕期组织学CINⅡ消退为LSIL及以下)，CINⅢ 12例(2例由CINⅡ进展为CINⅢ)，HSIL自然消退率为47.5%。联合免疫组化分析，结果显示单独p16+诊断产后组织学HSIL较p16+联合Ki-67+具有更高的敏感度(68.9% vs 26.7%，P<0.001)，但特异度较低(65.6% vs 84.4%，P=0.014)；p16+联合RELA+较p16+联合Ki-67+具有相当的特异度(89.1% vs 84.4%，P=0.435)，但敏感度较低(57.8% vs 26.7%，P=0.003)；p16+联合RELA+和(或)YAP1+较单独p16+具有相当的敏感度(66.7% vs 68.9%，P=0.822)及更高的特异度(84.4% vs 65.6%，P=0.014)。p16+联合RELA+和(或)YAP1+具有最高的约登指数0.510。见表2。ROC曲线提示p16+联合RELA+和(或)YAP1+诊断产后组织学HSIL具有最大曲线下面积0.747(95%CI=0.650～0.845)。见表2、图2。

表2 联合分子标志物诊断产后高级别上皮内病变的效能评价

3 讨 论

随着我国三孩政策的开放，孕产妇总人数及高危孕产妇比例升高，妊娠合并宫颈癌发病也将呈上升趋势。研究显示，妊娠期组织学确诊的HSIL仍具有较高的自然转归率，然而其原因仍不清。

Ahdoot等[9]研究认为，孕期多次行宫颈活检，导致部分或全部病灶被去除，从而使产后病变自然转阴率提高。此外，一些研究认为，在阴道镜活检过程中宫颈上皮完整性的破坏可能引发局部免疫反应，导致病灶的转归[3]。分娩方式对妊娠期HSIL的转归影响仍存在争议。一些学者发现，阴道分娩较剖宫产具有更高的转归率(67% vs 13%)[10]。Para等[11]认为，其机制可能是宫颈创伤，尤其是在分娩过程中发生的创伤可能导致宫颈上皮的炎症反应，或宫颈成熟过程中发育不良的宫颈上皮丢失，以及胎儿通过产道的过程导致病变处的宫颈上皮受损修复过程中被正常上皮所替代所致。另外，阴道分娩期间的短暂缺血性变化可能与产后宫颈病变的消退相关[12]。近年来，也有部分研究并未发现分娩方式与产后宫颈病变的转归之间存在任何关联[13]。其认为妊娠特殊的激素水平导致孕妇免疫力降低，因此孕期易导致HPV感染及宫颈病变，并根据孕期与非孕期宫颈病变病灶中Ki-67表达差异推测妊娠期特殊的激素水平及免疫机制可能影响细胞周期调控蛋白的表达从而干扰高危HPV诱导的致癌过程，进而干扰病变进展。另一方面，由于产后激素水平和免疫力的恢复，产妇HPV感染逐渐转阴，使妊娠期宫颈病变自然消退率增加[6，13]。

目前关于妊娠期宫颈上皮内病变高危标志物的研究仍较少，妊娠期行阴道镜活检的获益可能仍较低。本研究中妊娠期HPV及TCT筛查结果异常后行阴道镜活检检出组织学HSIL为50.8%。因此，有必要探索有效的标志物，以避免过度诊疗和不必要的侵入性检查。

p16基因产物是一种细胞周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制剂，持续性HPV感染伴随的细胞异常增生会导致p16过表达。Galgano等报告，p16免疫染色检出组织学HSIL的敏感度为86.7%,特异度为82.8%[14]。Ki-67是一种标志细胞增殖的核抗原。在正常细胞中，p16和Ki67表达相互拮抗，p16与Ki67同时过表达提示细胞周期调控失衡，存在病变。LAST指南中提议，H&E染色形态学鉴别存在争议时，可进一步行p16染色以提高HSIL诊断的一致性。p16阳性的CINⅡ建议归为HSIL，p16/Ki67阴性的CINⅡ建议归为LSIL[8]。

SMAD3是一种介导多种信号通路的信号转导和转录调节因子，在癌症发生的调节中发挥作用。最近的研究表明，Twist在宫颈癌发生过程中通过调节TGF-β/Smad3信号通路诱导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，并且TGF-β/Smad3信号的激活可诱导宫颈癌细胞系的迁移和侵袭[15]。YAP1编码Hippo信号通路的下游核内效应器，参与发育、生长、修复和体内平衡。YAP1蛋白在浸润性宫颈癌和宫颈高级别鳞状上皮内病变中均上调，YAP1与HPV感染相关，HPV E6蛋白可抑制YAP1蛋白的降解，HPV E7蛋白通过靶向PTPN14促进YAP1蛋白在细胞核中的表达。HPV E6/E7诱导的YAP1蛋白积累及其释放到细胞核的组合导致YAP1的剧烈活化，这可能是其促进宫颈上皮细胞增殖并最终导致宫颈癌变的机制[16-17]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)与许多癌症的发病机制有关，其在细胞增殖、迁移、血管生成和凋亡多种基因功能方面发挥着关键作用。RELA是NF-κB1基因的产物并与该基因复合形成NF-κB最丰富的形式。而HPV感染能促进RELA表达增加，HPV16通过HPV E6/E7癌基因的过表达及其与NF-κB的功能相互作用促进HPV所致肿瘤的进展及分化，且RELA过表达与宫颈肿瘤的进展相关[18-19]。最近，有研究者通过系统分析细胞形态相关基因与关键EMT转录因子之间的相互作用，证实SMAD3、RELA和YAP1在细胞形态信息传感方面发挥了重要作用[20]。

既往对宫颈鳞状上皮内病变的研究发现，p16联合SMAD3/RELA/YAP1的高表达在检出组织学HSIL中具有良好的敏感度和特异度[7]。本研究结果显示，在妊娠期宫颈上皮内病变中除SMAD3外，p16等在宫颈高级别上皮内病变中的表达明显升高，且p16+联合RELA+和(或)YAP1+较p16+、Ki-67+在诊断产后组织学HSIL中同时具有更高的敏感度及特异度，且具有最大ROC曲线下面积，在诊断妊娠期持续组织学HSIL中具有更好的效能。推测可能是由于持续HPV感染导致妊娠期宫颈病变中p16过表达。而YAP1、RELA与HPV感染所致宫颈病变的进展密切相关，更重要的是，两者均在病变细胞形态改变过程中发挥重要作用。因此，p16联合RELA和(或)YAP1的异常表达，能从分子水平反应出妊娠期持续性HPV感染引起的宫颈上皮细胞周期表达异常及细胞形态的改变，提示病变有进展可能，从而提高诊断的敏感度及特异度。而病灶中Ki-67的表达受妊娠期特殊的激素水平及免疫机制的影响无法准确反应出病变进展的情况。然而，对p16、YAP1及RELA对妊娠期宫颈病变进展的影响机制仍需更进一步的探索。

本研究通过对阴道镜活检病理免疫组化染色，探索对妊娠期宫颈病变持续存在或进展有提示意义的标志物，以提高对持续性宫颈高级别上皮内病变的检出率，降低大部分能够自然转归产妇在孕期行阴道镜检查的频率。另一方面，为后续在妊娠期宫颈脱落细胞中相关标志物的研究提供理论基础，以期探索可以应用于阴道镜转诊前的分流方案。综上所述，妊娠合并高级别宫颈鳞状上皮内病变患者约半数以上可自然消退，p16、YAP1及RELA高表达对持续组织学HSIL有较高的诊断价值，但仍需进一步扩大样本量及相关细胞学研究。