单细胞激光光镊拉曼光谱技术分析子宫内膜异位症患者子宫内膜细胞代谢特性的研究 *

张 琳,蒋锦杏,邓春艳**,杨 熠,王若琳,任莉莉,齐 晖,马利国

[深圳市人民医院(暨南大学第二临床医学院，南方科技大学第一附属医院) a.妇科；b.生物治疗室，深圳 518020]

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)简称内异症，是指子宫内膜组织在子宫腔以外出现异常生长，是一种以痛经、不孕为主要临床表现的常见女性生殖系统疾病，在育龄妇女中发病率达10%[1]。目前内异症的发病机制仍不明确，从“经血逆流种植学说”到“在位内膜决定论”[2]。从异位病灶细胞的“干细胞学说”[3]到类似恶性肿瘤细胞的“高侵袭性”[4]，遗传、内分泌、免疫、微生物和环境等因素均已被报道与EMs的发生发展密切相关[2]。因此，从多种角度分析异位内膜与在位内膜的差异，将为EMs的发病机制与治疗提供更好的指导。

拉曼光谱技术是研究代谢组学的方法学之一，通过对光谱的位置、强度和宽度进行分析，可获得样品中最相关的生物分子(蛋白质、脂类、糖和核酸等)的独特分子指纹，已被用于评估亚细胞水平上可能伴随疾病发生的特定生物学过程，如细胞活动、代谢和氧化应激等[5]。单细胞激光光镊拉曼光谱技术是是结合光学囚禁技术实现对悬浮单个细胞的研究，可更精准便捷地获取单细胞水平的代谢或生化特征[6]。本研究采用该技术分析比较内异症及子宫肌瘤对照患者子宫内膜细胞拉曼光谱，从分子代谢水平上探讨EMs的发病机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2018年10月至2019年10月深圳市人民医院收治的内异症患者共9例，年龄30～43岁，月经规律，周期28～32d，无其它内外科合并症，术前3个月内未服用激素类药物；经术中腹腔镜检查及病理检测确诊，按美国生育学会分期法(R-AFS)，患者均为Ⅲ～IV期盆腔EMs，留取在位、异位内膜组织分别为内异症A组、B组。选择同期行子宫肌瘤切除术的6例患者，年龄32～46岁，留取内膜组织作为对照组(病理证实均为正常子宫内膜组织)。两组患者的年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05),所取内膜均为增生期内膜。本研究通过医院伦理委员会批准，患者均知情并签署知情同意书。

1.2 样品处理 新鲜子宫内膜组织用D-Hanks液(Sigma-Aldrich公司)冲洗3次，剪成约(0.5～1.0)mm3大的碎块，置于带盖的15ml离心管，加4～5mL预热至37℃的IV型胶原酶(2mg/mL，Gibco公司)，混匀，置37℃水浴锅中消化。每5～10min用吸管轻轻吹打细胞，20min后取出静置片刻，待组织下沉后，吸出2/3上清液转移至新的15 mL离心管，加含DMEM/F12培养液(Gibco公司)终止消化。剩余1/3再补加新的胶原酶液继续消化，消化时间20～30min，取上清液加含DMEM/F12培养液终止消化。将两次消化的细胞液以300g离心5min，吸除上清，细胞沉淀物用PBS液漂洗2遍，加4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich公司)固定，洗涤，加PBS液(Sigma-Aldrich公司)调整细胞浓度为1×104/mL，于4℃保存备用。

1.3 拉曼光谱获取 拉曼测量采用BioRam®激光共聚焦拉曼-光镊显微镜(CellTool GmbH，德国)进行，使用785nm波长、80mw功率的二极管激光器进行拉曼激发。散射光束通过60×水浸物镜 (Olympus，德国)收集，校正环设置为0.17mm。分析时将100μL细胞悬浮液置于75×25mm细胞培养微孔板(货号：543079，Greiner Bio-One GmbH，德国)，每个样品随机测量60个细胞，采集次数10次，曝光时间3s，光谱范围400～1800cm-1，该波段包含最有用的生物学信息。

1.4 数据处理及统计学分析 所得光谱导入仪器配套软件CT-RamSES(CellTool GmbH，德国)进行基线校正、去荧光、降噪及归一化等处理，以获得较为理想的细胞拉曼光谱信号。采用主成分分析(PCA)对数据进行可视化处理。PCA得分图用于在数据中寻找聚类，根据PCA载荷找到在被分析组之间显示显著光谱变化的相应位置。使用GraphPad Prism7.04对不同组别波峰强度进行比较分析，两组间数据比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 拉曼光谱峰值和对应的物质指认 本研究共获得子宫内膜细胞拉曼光谱共20例，包含对照组患者子宫内膜细胞6例，内异症患者在位和异位子宫内膜细胞各7例，其中5例内异症患者同时获得了在位和异位子宫内膜细胞的光谱。细胞光谱的拉曼峰位参考文献[5]进行归属，见表1。3组样本的平均光谱见图1，阴影表示标准差。在波数为400～1800cm-1之间可见3组细胞拉曼光谱波峰位置及形态大致相似，对照组与内异症患者在位子宫内膜细胞的拉曼光谱更为接近，部分波峰强度有差异，可充分反映出不同组别子宫内膜细胞内生物大分子的含量和成分。

表1 子宫内膜细胞拉曼光谱的峰位归属

PCA得分图显示，PC1(50.06%)、PC2(10.02%)、PC3(8.28%)共可以解释数据集变量68.36%的变异度，对照组(Ctrl，蓝色点)和内异症患者在位子宫内膜细胞(EMs-A，绿色点)差异较小，散点分布出现较大重叠，而内异症患者异位子宫内膜细胞(EMs-B，红色点)出现较大偏移。PCA载荷图提示，PC1、PC2、PC3分别于1445(蛋白质、脂类)、1525(类胡萝卜素)、1663(蛋白质、胶原、核酸)cm-1呈最大相关性。

2.2 内异症组在位子宫内膜细胞与对照组比较 内异症患者在位子宫内膜细胞与对照组拉曼峰的形态和位置呈现较好的一致性，两组之间最显著的光谱差异用黄色方框标出(图2A)。与对照组相比，内异症患者在位子宫内膜细胞在702(胆固醇)cm-1的波峰强度降低，在938(碳水化合物)、1005(蛋白质-苯丙氨酸、类胡萝卜素)、1161(类胡萝卜素、蛋白)、1525(类胡萝卜素)cm-1的波峰强度增高(图2A)。以PC1(55.06%)、PC2(12.42%)、PC3(5.91%)绘制的PCA聚类图中，两组细胞分布高度重叠，未形成独立的分群(图2B)。PCA载荷图提示PC1、PC2、PC3分别于1445(蛋白、脂类)、1525(类胡萝卜素)、1161(类胡萝卜素)cm-1呈最大相关性(图2C)。

2.3 内异症组异位子宫内膜细胞与对照组比较 内异症患者异位子宫内膜细胞与对照组拉曼峰的形态和位置大致相似，但多个波峰强度出现差异(图3A)。与对照组相比，内异症患者在位子宫内膜细胞在492(糖原)、758(蛋白质-色氨酸)、831(蛋白质-脯氨酸、酪氨酸)、853(蛋白质-酪氨酸)、960(胆固醇)、1132(脂类)、1209(蛋白质-酪氨酸、苯丙氨酸)、1245(蛋白质、胶原)、1589(蛋白质-苯丙氨酸)、1620(蛋白质-色氨酸)cm-1的波峰强度增高，在702(胆固醇)、720(脂类、核酸)、1094(核酸)、1161(类胡萝卜素、蛋白质)、1445(脂类、蛋白质)、1525(类胡萝卜素)、1663(蛋白质、胶原、核酸)cm-1的波峰强度降低。使用PC1(49.93%)、PC2(10.97%)、PC3(7.25%)绘制的PCA聚类图中，两组细胞部分重叠，内异症患者部分异位内膜细胞离群(图3B)。PCA载荷图(图3C)提示PC1和PC2均与1445(蛋白、脂类)cm-1呈最大相关性，PC3与1161(类胡萝卜素)cm-1呈最大相关性。

2.4 内异症组在位与异位子宫内膜细胞比较 内异症患者异位与在位子宫内膜细胞多个波峰强度出现差异(图4A)。与在位内膜相比，内异症患者异位子宫内膜细胞在492(糖原)、758(蛋白质-色氨酸)、831(蛋白质-脯氨酸、酪氨酸)、853(蛋白质-酪氨酸)、1132(脂类)、1209(蛋白质-酪氨酸、苯丙氨酸)、1245(蛋白质、胶原)、1589(蛋白质-苯丙氨酸)、1620(蛋白质-色氨酸)cm-1的波峰强度增高，在720(脂类、核酸)、938(碳水化合物、胶原)、1005(蛋白质-苯丙氨酸、类胡萝卜素)、1094(核酸)、1161(类胡萝卜素、蛋白质)、1445(脂类、蛋白质)、1525(类胡萝卜素)、1663(蛋白质、胶原、核酸)cm-1的波峰强度降低。使用PC1(48.06%)、PC2(11.90%)、PC3(8.04%)绘制的PCA聚类图中，两组细胞部分重叠，内异症患者部分异位内膜细胞离群(图4B)。PCA载荷图(图4C)提示PC1、PC2、PC3分别与1445(蛋白、脂类)、1663(蛋白质、胶原、核酸)、1161(类胡萝卜素)cm-1呈最大相关性。

来源于同一患者的在位与异位子宫内膜细胞拉曼平均光谱如图5A。与在位内膜相比，该患者的异位子宫内膜细胞在492(糖原)、758(蛋白质-色氨酸)、831(蛋白质-脯氨酸、酪氨酸)、853(蛋白质-酪氨酸)、1005(蛋白质-苯丙氨酸、类胡萝卜素)、1132(脂类)、1209(蛋白质-酪氨酸、苯丙氨酸)、1245(蛋白质、胶原)、1589(蛋白质-苯丙氨酸)、1620(蛋白质-色氨酸)cm-1的波峰强度增高，在702(胆固醇)、720(脂类、核酸)、938(碳水化合物、胶原)、1094(核酸)、1161(类胡萝卜素、蛋白质)、1445(脂类、蛋白质)、1525(类胡萝卜素)、1663(蛋白质、胶原、核酸)cm-1的波峰强度降低。以PC1(58.53%)、PC2(13.22%)绘制的PCA聚类图中，该患者两组不同来源的细胞分群明显(图5B)。

3 讨 论

细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面的，如细胞信号释放、能量传递、细胞间通信等都是受代谢物调控的，代谢物更多地反映了细胞所处的环境。细胞代谢失调可导致包括癌症在内的多种人类疾病[7]。尽管现已广泛认为代谢组学在许多疾病的发病机制、诊断和治疗监测方面具有巨大的潜力，在该领域内研究子宫内膜异位症仍处于初期阶段[8]。基于核磁共振和质谱方法学对EMs患者的子宫内膜液[9]、内膜组织[5]、卵泡液[10]、尿液[11]、血清[12]和血浆[13]进行的代谢组学研究显示，患者的代谢产物发生了显著变化。拉曼光谱技术也是研究代谢组学的方法学之一，其谱带的移动和变化可以解释为某些化学物质的结构和数量的变化，这可能影响细胞的功能并涉及疾病的发展[14]。Notarstefano等[15]将红外和拉曼两种光谱技术结合应用，揭示了由内异症病理引起的卵巢颗粒细胞代谢和生化组成的改变，包括蛋白质模式的改变、氧化应激机制的诱导以及脂质和碳水化合物代谢的紊乱等。Parlatan等[16]使用拉曼光谱技术检测EMs患者和正常对照血清光谱，结合PCA和分类算法，尝试建立一种无创血清诊断EMs的方法。

本研究中，使用单细胞激光光镊拉曼技术为基础的代谢组学研究方法揭示了盆腔EMs(Ⅲ～Ⅳ期)患者子宫内膜细胞的代谢物变化。激光光镊拉曼光谱分析技术是一种将激光光镊与共聚焦拉曼光谱技术相结合的产物，能保证在生理条件下捕获、操控、测量在悬浮状态下单个活细胞并对其进行生物学分析研究，作为一种有效的非标记、无损伤的单个生物分子分析方法，在细胞生物学研究领域展现出广泛的应用前景[6]。本研究发现，EMs患者在位、异位子宫内膜细胞与对照组子宫肌瘤患者子宫内膜细胞拉曼峰的位置大致相同，但是存在波峰强度的差别。虽然收集到的拉曼光谱是多个大分子的综合贡献，但在谱带强度方面，浓度较高的分子对光谱的贡献更大。本结果提示，与患者在位子宫内膜和对照组子宫内膜相比，异位子宫内膜细胞内胆固醇(702cm-1)、类胡萝卜素(1161、1525cm-1)、核酸(1094cm-1)等成分减少，而蛋白(758、831、853、1209、1245、1589cm-1)、脂类(1132cm-1)、糖原(492cm-1)相关的成分增加，可能反映了其存在较强的细胞呼吸和增殖代谢。通过PCA聚类分析可以看出，EMs患者在位子宫内膜细胞与对照组子宫内膜细胞光谱相似性较高，而异位子宫内膜细胞中出现离群细胞，提示异位子宫内膜细胞的细胞代谢出现了较大的改变。

EMs是激素依赖性疾病，内膜细胞存在激素代谢的异常[2]。雌孕激素通过细胞外信号调节激酶刺激内膜细胞增殖、抑制细胞凋亡，在种植的病灶中异位内膜细胞还可自我产生雌激素[17-18]。胆固醇作为甾体类激素的前体物质，在本研究中相关拉曼峰振动强度表现为：异位内膜最低，在位内膜次之，均低于对照内膜。这一变化提示EMs患者在位和异位子宫内膜细胞内胆固醇消耗较多，从亚细胞水平更进一步证实了EMs患者体内的激素代谢异常，消耗的胆固醇可能正是被用于合成了甾体类激素。

此外，EMs患者常伴有脂代谢异常[19]。患有EMs的妇女有较低的体质量指数和体脂，其体内脂肪干细胞水平较低并伴有脂肪代谢基因的改变[20]。EMs中相对升高的雌激素水平，通过雌激素受体，也可能直接或通过调控子宫内膜外泌体，显著抑制骨髓中脂肪细胞的生成[21]，以及脂肪细胞中甘油三酯的积累[22]。本研究提示，EMs患者异位内膜细胞内脂类物质聚集增加，可能涉及脂代谢通路异常的某些环节，相关机制尚需进一步研究。

本研究结果还揭示了EMs患者子宫内膜细胞中类胡萝卜素代谢的变化。Taylor等[23]研究表明，异位子宫内膜组织中类胡萝卜素减少，而且EMs患者体内维甲酸的代谢和作用从根本上是有缺陷的。Parlatan等[16]检测的EMs患者血清拉曼光谱中也提示了类胡萝卜素的差异。类胡萝卜素在结构上与维甲酸类似，二者具有多种类似的生物活性，如抗氧化性能、抑制恶性肿瘤生长和诱导细胞凋亡，可影响细胞生长、调节基因表达和免疫反应，还能抑制细胞侵袭、血管生成和转移，其抗炎活性也被认为是其抑制肿瘤发生和发展的重要机制[24]。内异症虽为良性疾病，但其细胞浸润、增生及复发等均属于恶性生物学行为。已证实内异症患者异位内膜间质细胞的间隙连接细胞间通讯功能(gap junctional intercellular communication,GJIC)丧失与疾病的发病密切相关，而类胡萝卜素、维甲酸可上调或恢复内异症及某些肿瘤细胞的GJIC功能[25]。因此，推测EMs患者异位内膜细胞中降低的类胡萝卜素水平可能有利于异位的子宫内膜细胞发生类似于肿瘤特性的生长。另一方面，本研究还发现，EMs患者在位子宫内膜细胞中的类胡萝卜素水平较对照组增加，提示机体可能存在某种反馈调节机制，或尚有其它混杂因素(例如免疫微环境)影响了细胞的代谢水平。

综上所述，本研究采用单细胞激光光镊拉曼光谱分析技术，发现EMs患者在位、异位子宫内膜细胞存在多种代谢改变。本研究中发现的这些改变所引起的影响可能是复杂的，在EMs中发生发展中的因果关系也尚不清楚，但这些生化代谢产物的变化反映了异位子宫内膜细胞的异常生物学特性，将为理解疾病的发生发展提供一种新的视野，也将有望提供新的治疗靶点。