普罗布考对高脂血症大鼠脑缺血再灌注的脑保护作用及机制研究*

王建平，张 杰，赵洪云

(河北省沧州市中心医院：1.神经内科；2.CT诊断科 061000)

脑卒中亦称“中风”，是1种急性脑血管疾病，包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中，其中，缺血性脑卒中占全部脑血管疾病的70%～80%，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率等特征[1]。大动脉粥样硬化狭窄是缺血性脑卒中最常见的亚型，高脂血症是脑动脉狭窄的高危因素[2-3]。目前，临床上有效治疗缺血性脑卒中的手段是在时间窗内通过溶栓或取栓等恢复半暗带的血氧供应，使闭塞血管血液得到再灌注，减轻脑组织缺血缺氧的损伤，改善患者预后[4]。但再灌注同时会加重缺血细胞损伤，甚至发展为不可逆损伤即脑缺血再灌注损伤[5]。因此，寻找有效减轻脑缺血再灌注损伤的药物对提高缺血性脑卒中的治疗效果，改善患者预后具有重要意义。普罗布考是1种新型降脂药物，具有抗氧化、抗炎，抑制动脉粥样硬化因子表达，减少动脉粥样硬化斑块及提高血管内皮舒张功能等作用[6-7]。近年研究显示，普罗布考在脑出血高风险的缺血性脑卒中患者治疗中发挥了重要作用[8]。本研究拟通过建立高脂血症大脑中动脉阻断大鼠模型经普罗布考治疗并检测相关指标，探讨普罗布考对其脑缺血再灌注的脑保护作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

无特定病原体(SPF)级SD大鼠140只，雌雄各半，7周龄，体重(220±20 g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2016-0011。饲养环境：温度20～25 ℃，相对湿度45%～55%，光照周期12 h，根据国家实验动物管理条例进行喂养。本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.1.2药品、主要试剂和仪器

普罗布考0.25 克/片(承德颈复康药业集团有限公司)；TTC(美国Sigma公司)；大鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA试剂盒(美国R&D公司)；兔抗鼠p-p65、NF-κB p65、β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔二抗(英国Abcam公司)；全自动生化分析仪及配套试剂(山东科生物产业有限公司)；多功能酶标仪(美国Molecular Device公司)；蛋白凝胶电泳仪(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1动物分组与模型制备[9]

140只SD大鼠分为：普通组(20只)，高脂组(120只)，采用自然进食法制备高脂血症模型。普通组给予普通饲料喂养，高脂组给予高脂饲料(基础饲料79.3%、蛋黄粉10%、胆固醇5%、猪油5%、猪胆盐0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%)喂养8周，空腹12 h后取大鼠尾尖静脉血，全自动生化分析仪及配套试剂检测其血脂四项：总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(low-density lipid cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白-胆固醇(high-density lipid cholesterol，HDL-C)。

1.2.2分组及干预

120只造模成功的高脂血症大鼠采用随机数字表法分为：高脂组、缺血再灌注组、低剂量普罗布考组、高剂量普罗布考组，每组30只。普罗布考低剂量组、普罗布考高剂量组分别给予0.5%羧甲基纤维素(CMC)配制的普罗布考混悬液100 mg/kg、500 mg/kg灌胃，高脂组、缺血再灌注组同时给予相同剂量不含普罗布考的0.5% CMC灌胃，1次/天，连续4周。

1.2.3建立大脑中动脉阻断模型[10]

缺血再灌注组、普罗布考低剂量组、普罗布考高剂量组采用改良Longa法建立大脑中动脉阻断模型，10%水合氯醛腹腔麻醉后，经颈正中切口，依次分离右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，在距颈总动脉分叉5 mm处剪一“V”形切口，将处理好的鱼线插入颈总动脉，深度约18 mm，至大脑中动脉，结扎并固定鱼线，缝合皮肤，阻断血流2 h后，分别拔出鱼线进行再灌注。假手术组大鼠除不插鱼线外，其余步骤同前，根据Longa评分标准判断造模是否成功。评分原则，0分：表现正常，无明显神经功能缺损症状和体征；1分：左前肢屈曲无力，不能完全伸直；2分：行走向左侧旋转；3分：行走时向左侧倾倒，站立不稳；4分：不能自行行走，意识障碍。1～3分大鼠为造模成功。缺血再灌注组术后死亡2只，蛛网膜下腔出血死亡1只；普罗布考低剂量组和普罗布考高剂量组分别因蛛网膜下腔出血死亡1只。

1.2.4各组大鼠神经功能缺损评分

造模成功大鼠根据再灌注不同时间点(6、12、24、48、72 h)分为5个亚组，每组取5只，对大鼠进行提尾反射测试、行走测试、感觉测试、平衡性测试、反常运动和反射缺失测试。根据Garcia评分细则[11]进行神经功能缺损评分(modified neurological severity score，mNSS)，得分最低3分，最高18分，分数越低表示神经功能障碍越重。

1.2.52，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测各组大鼠脑梗死体积

造模成功大鼠缺血再灌注后24 h每组取5只，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，快速断头取脑，将新鲜脑组织置于-20 ℃冰箱20 min，脑组织切去小脑及低位脑干，沿脑组织冠状面依次切成2 mm厚的切片，立即放于2% TTC磷酸缓冲液中，37 ℃避光染色30 min，4%甲醛固定，将已染色的脑组织规律摆放，进行照相后采用Image Pro Plus 6.0图像处理软件进行分析，计算脑梗死体积比(V)。计算公式：V=[(A1+A2)/2×t)]/[(A3+A4)/2×t)]×100%，其中，A1和A2为各脑片正反面梗死面积(mm2)，A3和A4为各脑片正反面面积(mm2)，t为切片厚度(mm)。

1.2.6ELISA检测缺血脑组织TNF-α、IL-1β水平

取部分缺血脑组织，匀浆器将其充分匀浆，3 000 r/min(离心半径8 cm)离心20 min，收集上清液。设置空白孔、标准品孔及样品孔，标准品孔加50 μL梯度稀释的标准品，样品孔先加40 μL样品稀释液，再加10 μL样品，振荡混匀后封板，37 ℃孵育30 min，洗涤液清洗5次，除空白孔外每孔加50 μL酶标试剂，混匀后封板，37 ℃孵育1 h，洗涤液清洗5次，每孔加100 μL显色液，混匀后37 ℃避光显色20 min，标准品孔出现颜色梯度变化时，每孔加50 μL终止液，15 min内以空白孔调零，酶标仪450 nm波长外测量各孔光密度(OD)值，以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，采用CurveExpert软件绘制标准曲线，计算样品中TNF-α、IL-1β水平，实验重复3次。

1.2.7Western blot检测缺血脑组织NF-κB通路相关蛋白表达水平

取120 mg冷冻缺血脑组织，液氮研磨后加RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度，蛋白煮沸变性，取等量总蛋白行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)电泳，电泳条件：80 V恒压电泳浓缩蛋白20 min，100 V恒压电泳分离蛋白约1 h至溴酚蓝接近蛋白胶板底端，转膜仪将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，转膜条件：300 mA恒流转膜1 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别用1∶1 000稀释的p-p65、NF-κB p65、β-actin一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再用1∶2 000稀释的过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化学发光液浸膜，暗室曝光显影，Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值/内参β-actin蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白表达水平，实验重复3次。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 普通组与高脂血症组大鼠血脂四项

大鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平组间比较，差异有统计学意义P<0.05)。与普通组比较，高脂血症组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低(P<0.05)，见表1。

2.2 各组大鼠mNSS

大鼠mNSS组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠再灌注不同时间点mNSS降低(P<0.05)；与模型组比较，普罗布考低剂量组、普罗布考高剂量组大鼠再灌注不同时间点mNSS升高(P<0.05)；与普罗布考低剂量组比较，普罗布考高剂量组大鼠再灌注6、48、72 h mNSS升高(P<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠血脂四项水平比较

表2 各组大鼠再灌注后不同时间点神经功能缺损评分分，n=5)

2.3 各组大鼠脑梗死体积

大鼠脑梗死体积组间比较，差异有统计学意义(F=305.905，P<0.001)。与缺血再灌注组[(178.59±15.53)mm3]比较，普罗布考低剂量组[(119.82±10.42)mm3]、普罗布考高剂量组[(97.34±11.61)mm3]大鼠脑梗死体积减小(P<0.05)；与普罗布考低剂量组比较，普罗布考高剂量组大鼠脑梗死体积减小(P<0.05)。

2.4 各组大鼠缺血脑组织TNF-α、IL-1β水平

大鼠缺血脑组织TNF-α、IL-1β水平组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠缺血脑组织TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)；与缺血再灌注组比较，普罗布考低剂量组、普罗布考高剂量组大鼠缺血脑组织TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)；与普罗布考低剂量组比较，普罗布考高剂量组大鼠缺血脑组织TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)。见表3。

2.5 各组大鼠缺血脑组织NF-κB通路相关蛋白表达水平

大鼠缺血脑组织p-p65蛋白表达水平组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠缺血脑组织p-p65蛋白表达水平升高(P<0.05)；与缺血再灌注组比较，普罗布考低剂量组、普罗布考高剂量组大鼠缺血脑组织p-p65蛋白表达水平降低(P<0.05)；与普罗布考低剂量组比较，普罗布考高剂量组大鼠缺血脑组织p-p65蛋白表达水平降低(P<0.05)，各组大鼠缺血脑组织NF-κB p65蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P<0.05)。见图1，表4。

表3 各组大鼠缺血脑组织TNF-α、IL-1β水平

A：假手术组;B：缺血再灌注组;C：普罗布考低剂量组;D：普罗布考高剂量组。

表4 各组大鼠缺血脑组织NF-κB p65、p-p65 蛋白表达水平

3 讨 论

脑血管病是全球主要的健康问题之一，包括脑动脉粥样硬化、脑动脉炎、脑动脉损伤、脑动脉瘤、颅内血管畸形和脑动静脉瘘等，大、小脑血管病变均可触发脑卒中[12]。目前，我国每年脑血管病新发病例约250万，死亡人数约150万，而大概75%幸存患者留有不同程度的后遗症[6]。其中，缺血性脑卒中是由于颈动脉和椎动脉等脑部供血动脉狭窄、闭塞引起脑组织缺血缺氧及缺血再灌注导致的炎性反应、酸中毒、自由基生成等一系列病理变化[13-15]。脑缺血再灌注损伤包括血管通透性增加、血脑屏障破坏和脑水肿等，是导致缺血性脑卒中患者预后不良的关键因素[16]。缺血性脑卒中患者死亡的脑细胞周围存在大量神经元，因此有效恢复血氧供应，减小动脉斑块面积，减轻神经细胞损伤及降低血脂可以显著改善患者的神经功能。临床上常以静脉溶栓和血管内血栓切除术进行快速再灌注，以及血压控制、胆固醇管理和抗血栓药物等二级预防方式[17]进行处理。

普罗布考是1种具有抗氧化和抗炎特性的酚类化合物降脂剂，已用于临床治疗和预防心血管疾病[18]。NAKAGAWA 等[19]研究表明，普罗布考在体外血脑屏障模型中可减轻氧糖剥夺/复氧引起的跨内皮电阻降低和通透性增加；在小鼠大脑中动脉阻断再灌注模型中可减小术后脑梗死面积和血管渗漏并保持紧密连接蛋白的完整性。杨成等[20]研究发现，普罗布考可以提高缺血再灌注损伤大鼠血及肾组织中超氧化物歧化酶活性，改善肾功能，降低血脂水平，减轻肾组织病理损伤，发挥肾脏保护作用。曾洪艳等[21]研究显示，普罗布考可通过转化生长因子β1/Smad2/3通路减轻大鼠脑缺血再灌注的炎性损伤。本研究建立高脂血症大脑中动脉阻断大鼠模型，经普罗布考治疗后发现大鼠脑缺血再灌注不同时间点mNSS升高、脑梗死体积减小，缺血脑组织TNF-α、IL-1β水平降低，提示普罗布考可减轻高脂血症大鼠脑缺血再灌注损伤，发挥脑保护作用。

NF-κB是1种早期核转录因子，通过与靶基因启动子/增强子区域的特定序列结合并启动基因转录。静息状态下，NF-κB通常以p50/p65二聚体形式与NF-κB抑制剂(IκB)结合形成无活性异源复合体存在于细胞质中，细胞外信号刺激下，IκB激酶复合体将IκB磷酸化，复合体解离并释放NF-κB，游离的NF-κB从细胞质转移至细胞核，p65亚基与靶基因κB结合位点结合启动或增强基因如TNF-α、IL-1β等的转录，导致炎性反应[22]。LIANG等[23]研究发现，远程缺血预处理可通过调控NF-κB通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，发挥神经保护作用。WU等[24]研究表明，长春西汀通过调控Toll样受体4/髓样分化因子88/NF-κB通路抑制炎性反应，减轻脑缺血再灌注损伤。本研究结果显示，经普罗布考治疗后，高脂血症大脑中动脉阻断大鼠缺血脑组织p-p65蛋白表达水平降低，提示普罗布考可能通过调控NF-κB通路发挥对高脂血症大脑中动脉阻断大鼠缺血再灌注的脑保护作用。

综上所述，普罗布考对高脂血症大鼠脑缺血再灌注具有脑保护作用，其机制可能与调控NF-κB通路及下游相关炎症因子的表达有关。本研究为普罗布考应用于高脂血症合并缺血性脑卒中的临床治疗提供理论支持。