Nrf2调控AIM2炎症小体在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用

2022-04-21侯万梅官劲帆刘炳园林冬融赵远瑜张娟梓韩江全

天津医药 2022年4期

侯万梅，官劲帆，刘炳园，林冬融，赵远瑜，张娟梓，韩江全

缺血性脑卒中是严重威胁人类健康的常见疾病，但目前治疗手段有限，深入研究脑缺血损伤的机制，寻找其治疗靶点及调控机制具有重要意义。脑缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中疾病进展的关键环节，而炎症反应是缺血再灌注损伤的重要病理生理机制［1］。研究发现，脑缺血再灌注损伤可诱导黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）炎症小体活化，促进炎性因子的成熟和释放，放大炎症反应，加重脑损伤［2］；而AIM2基因敲除或抑制AIM2炎症小体活化可显著改善脑缺血再灌注损伤［3］。核因子E2 相关因子2（Nrf2）作为调控内源性抗氧化应激损伤的转录因子，可通过抗炎、抗氧化应激、调节细胞凋亡等多个途径在脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用［4］。Nrf2与AIM2及NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）等炎症小体之间存在交互作用［5］。但Nrf2 是否通过调控AIM2 炎症小体而发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用目前仍不清楚。本研究旨在探讨Nrf2 对脑缺血再灌注损伤的影响及AIM2 炎症小体的调控作用，以期为缺血性脑卒中的防治提供作用靶点及实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 SPF级健康成年雄性SD大鼠108只，8～10周龄，体质量250～280 g，购自珠海百试通生物科技有限公司［动物许可证编号为SCXK（粤）：20200051］。所有大鼠饲养在温度为（22±1）℃、湿度为（55±5）%，12 h 光照/12 h 黑暗的笼内，予自由饮水和进食，适应性喂养7 d。按随机数字表法将大鼠分为：假手术组（Sham组）、脑缺血再灌注模型组（I/R 组）、Nrf2 抑制剂鸦胆子苦醇（Brusatol，Bru）干预组（Bru组），每组再按随机数字表法根据脑缺血再灌注后不同时间点进一步分为8、24、72 h组，共9组，每组12只。本研究经遵义医科大学第五附属（珠海）医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂及仪器 Brusatol（美国Sigma公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，美国MPBIO 公司）；兔抗大鼠AIM2、Nrf2 多克隆抗体（英国Abcam 公司）；白细胞介素（IL）-1β、IL-18、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-1 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（中国Boster公司）；TRIZOL（中国天根生物公司）；苏木素染液及伊红染液（北京索莱宝公司）；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）及十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶配制试剂盒（上海碧云天公司）；BIO-RAD电泳仪/电泳槽（美国伯乐生命医学产品有限公司）；Mx3000P 荧光定量PCR（qPCR）仪（美国安捷伦有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 模型建立 Bru组大鼠于建模前30 min经侧脑室注入Brusato（l1 mg/kg，溶于5µL 1%二甲基亚砜），Sham 组和I/R组于相应时间予侧脑室注入等量的溶剂。I/R 组和Bru 组大鼠采用文献［6］提出的线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）的局灶性脑缺血再灌注损伤模型。造模前先予大鼠禁食、不禁水12 h，用5%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，取仰卧位固定，剃除颈部毛发并用碘伏消毒。于颈部正中行长1.5～2.0 cm 的纵行切口，分离并显露左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，沿颈总动脉、颈内动脉插入1条特制的硅涂层栓线［线直径0.28 mm，头径（0.38±0.02）mm］，插入18～20 mm 微遇阻力时停止。记录大鼠脑缺血开始的时间（栓线成功插入时），并缝合颈部皮肤。在脑缺血后90 min，予拆除缝线，缓慢拔出线栓，造成再灌注损伤。Sham组除不插入线栓外，其余操作均同上。造模期间将造模环境温度维持在25～30 ℃，并使用直肠探头监测体温，在整个手术过程中将体温保持在（37.0±0.5）℃。

1.3.2 神经功能缺损评分各组大鼠分别于脑缺血再灌注后8、24、72 h 进行神经功能缺损评分。评分标准参照Bederson 评分法［7］：0 分，无神经功能缺损症状；1 分，手术对侧前肢呈内收屈曲位，不能完全伸展；2分，向手术对侧推时抵抗力下降；3分，术后行走时向手术对侧转圈；4分，术后行走时向手术对侧倾倒；5 分，无自发性活动，对刺激无反应。评分1～4 分为模型建立成功，纳入实验范畴，造模不成功或未到时间点已死亡者，按照随机原则补充实验大鼠，重新建立脑缺血再灌注损伤模型。

1.3.3 TTC染色测定脑梗死面积脑缺血再灌注后8、24、72 h分别从相应时间点组大鼠中采用简单随机抽样法抽取6只大鼠，用5%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，立即处死并迅速取出脑组织，将脑组织以冠状位切面横切成5个厚度相当的切片，置于2% TTC 溶液中37 ℃孵育30 min，染色后用4%甲醛固定24 h，脑切片固定好后进行拍照。切片中红色区域为正常脑组织区域，白色区域为梗死区域，大脑切片图像用Image J 软件进行数字化处理并计算脑梗死面积百分比。脑梗死面积百分比=（对侧半脑组织面积-梗死侧正常面积）/对侧半脑组织面积×100%。

1.3.4 HE染色将大鼠麻醉后迅速断头取脑，放入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃放置固定48 h，24 h更换1次多聚甲醛溶液。固定完成后取出，常规取材、脱水、包埋、切片（厚度3.0µm）。将病理切片置于65 ℃的烘箱中烘烤2 h，用TO透明剂及梯度乙醇进行脱蜡处理，再进行HE 染色，中性树胶封片，光学显微镜观察组织形态及病理改变。

1.3.5 qPCR检测脑组织中AIM2 mRNA的表达用Trizol法提取缺血侧大脑组织的总RNA，经逆转录获取cDNA，以GAPDH 为内参，检测大鼠脑组织中AIM2 mRNA 的表达水平。引物设计如下：AIM2 上游5'-CACCCTCATGGACCTGTATCAT-3'，下游 5'-GAATCCAAGCCCTCTGCTCT-3'；GAPDH 上游 5'-TACTGTTGTCCAGCTACGGC-3'，下游 5'-CGTCCAAATCCATTGATGCCC-3'。反应条件：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 30 s，60 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。实验获得的定量基因表达数据，采用2-ΔΔCt法计算AIM2 mRMA的表达情况。

1.3.6 Western blot 检测 Nrf2 及 AIM2 蛋白表达称取 50 mg缺血侧脑组织放入匀浆器内，加入1 mL 裂解液（RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制剂混合物=100∶1∶1），在冰上迅速研磨，静置30 min后离心（12 000 r/min，4 ℃，20 min），静置后收集上清液，提取总蛋白，用BCA 法进行蛋白定量。将总蛋白加入等体积5×蛋白上样缓冲液后在沸水中煮15 min 使其变性，经SDS-PAGE，通过湿转法进行转膜，脱脂奶粉封闭，室温孵育1 h，加入相应的一抗，即兔抗大鼠AIM2（1∶1 000），兔抗大鼠Nrf2（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，应用TBST洗膜3次，每次10 min，采用山羊抗兔二抗（1∶5 000）继续孵育2 h，应用TBST 洗膜3 次，每次10 min，化学发光剂显影曝光，通过Image J软件对光密度值进行分析。

1.3.7 ELISA 检测ASC、Caspase-1、IL-1β 及 IL-18 蛋白的表达采集缺血侧大脑半球脑组织，将脑组织匀浆离心后，分离收集上清液。采用相应的ELISA 试剂盒检测大鼠缺血侧脑组织中ASC、Caspase-1、IL-1β及IL-18的表达水平。

1.4 统计学方法采用SPSS 18.0软件进行数据分析。计量资料进行正态性及方差齐性检验，符合正态分布或近似正态分布的均以均数±标准差（）表示。2组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），若方差齐，组间多重比较采用LSD-t检验；若方差不齐，组间多重比较采用Tamhane's T2 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分比较 I/R 组及Bru 组各时间点大鼠神经功能缺损评分较Sham 组升高；与I/R组相比，Bru组相应时间点的神经功能缺损评分均明显增加（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of neurological deficit scores between the three groups表1 3组大鼠神经功能缺损评分比较（n=12，分，）

＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与I/R组比较，P＜0.05。

组别Sham组I/R组Bru组F 8 h 0.00±0.00 1.50±0.52a 2.08±0.52ab 77.310＊＊24 h 0.00±0.00 2.50±0.67a 3.17±0.58ab 127.346＊＊72 h 0.00±0.00 2.33±0.65a 3.08±0.67ab 106.843＊＊

2.2 脑梗死面积百分比比较 Sham 组3 个时间点的大鼠脑组织切片均无白色梗死灶；I/R 组及Bru 组大鼠的脑组织在8、24、72 h 均呈现出不同范围的白色梗死区域；与I/R 组比较，Bru 组大鼠的脑梗死面积百分比更大（P＜0.05），见表2、图1。

2.3 各组大鼠脑皮质病理形态学变化 HE染色结果显示，Sham 组大鼠神经细胞形态结构正常，核仁清晰，呈淡蓝色，细胞为圆形或椭圆形，排列密集。I/R 组大鼠神经细胞排列紊乱，核仁深染，胞质与胞核之间界限不清、凝结在一起，且大量细胞与细胞外基质之间出现空泡。与I/R 组8 h 相比，24 h 和72 h病理损害更重，I/R 组24 h 和72 h 之间无明显差异。与I/R 组相比，Bru 组大鼠各相应时间点的病理损害明显更重，见图2。

Tab.2 Comparison of the percentage of cerebral infarction area in each group at different time points表2 各组大鼠不同时间点脑梗死面积百分比比较（n=6，%，）

＊P＜0.05。

组别I/R组Bru组t 8 h 6.54±5.08 14.74±6.43 2.451＊24 h 32.41±4.40 48.89±1.46 8.696＊72 h 25.70±3.27 43.82±4.48 8.011＊

2.4 缺血侧脑组织中AIM2 mRNA 表达情况与Sham 组相比，I/R 组及 Bru 组各时间点 AIM2 mRNA水平均明显升高（P＜0.05）；与I/R 组相比，Bru 组各相应时间点 AIM2 mRNA 水平更高（P＜0.05），见表3。

2.5 Nrf2、AIM2蛋白的表达水平与Sham组相比，I/R 组及Bru 组各时间点Nrf2 及AIM2 表达水平均明显升高（P＜0.05）；与I/R 组相比，Bru 组大鼠各时间点Nrf2蛋白表达水平均降低，AIM2蛋白表达水平均升高（P＜0.05）。见图3、4，表4。

Fig.1 Results of TTC stainning图1 TTC染色结果

Fig.2 Morphological manifestations of the cortical area of the ischemic side of brain tissue in each group of rats (HE staining,×400)图2 各组大鼠缺血侧脑组织皮质区形态学表现（HE染色，×400）

Tab.3 The relative expression level of AIM2 mRNA in brain tissues of each group at different time points表3 各组大鼠脑组织不同时间点AIM2 mRNA表达水平（n=6，）

＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与I/R组比较，P＜0.05。

组别Sham组I/R组Bru组F 1.00±0.00 1.77±0.12a 2.44±0.09ab 397.986＊＊1.06±0.045 7.22±0.47a 11.59±0.69ab 722.555＊＊1.06±0.038 3.98±0.53a 7.26±0.86ab 168.866＊＊8 h 24 h 72 h

Fig.3 Relative protein expression of Nrf2 in rat brain tissue of each group图3 各组大鼠脑组织Nrf2蛋白相对表达水平

Fig.4 Relative protein expression of AIM2 in rat brain tissue of each group图4 各组大鼠脑组织AIM2蛋白相对表达水平

Tab.4 Comparison of Nrf2 and AIM2 protein relative expression levels at different time points in brain tissues of rats in each group表4 各组大鼠脑组织不同时间点Nrf2和AIM2蛋白相对表达水平比较（n=6，）

＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与I/R组比较，P＜0.05。

组别Sham组I/R组Bru组F Nrf2蛋白8 h 0.32±0.02 0.61±0.02a 0.49±0.03ab 190.541＊＊24 h 0.37±0.02 1.28±0.07a 1.11±0.05ab 518.017＊＊72 h 0.40±0.05 1.07±0.06a 0.85±0.10ab 131.230＊＊组别Sham组I/R组Bru组F AIM2蛋白8 h 0.36±0.03 0.56±0.07a 0.70±0.05ab 68.632＊＊24 h 0.39±0.02 1.00±0.05a 1.18±0.03ab 892.462＊＊72 h 0.37±0.03 0.85±0.06a 1.06±0.03ab 429.034＊＊

2.6 脑组织中Caspase-1及炎症因子IL-1β、IL-18表达 Sham组、I/R组和Bru组ASC、Caspase-1、IL-1β及IL-18的蛋白表达水平依次升高（P＜0.05），见表5。

Tab.5 Comparison of protein expression levels of ASC,Caspase-1,IL-1β and IL-18 in brain tissues of each group at different time points表5 各组大鼠脑组织不同时间点ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达水平比较（n=12，ng/L，）

＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与I/R组比较，P＜0.05。

组别Sham组I/R组Bru组F ASC蛋白8 h 134.37±9.89 215.08±9.08a 260.29±7.53ab 309.141＊＊24 h 136.54±9.72 400.75±6.60a 461.22±5.78ab 3 131.750＊＊72 h 133.92±10.73 293.01±7.64a 340.15±7.13ab 936.989＊＊组别Sham组I/R组Bru组F Caspase-1蛋白8 h 16.16±1.09 37.78±1.63a 57.00±1.80ab 1 062.102＊＊24 h 16.22±1.05 72.76±2.96a 99.49±3.63ab 1 412.733＊＊72 h 15.95±1.05 48.47±2.84a 68.42±1.78ab 1 026.072＊＊组别Sham组I/R组Bru组F IL-18蛋白8 h 34.13±2.68 69.10±4.80a 98.38±3.29ab 454.373＊＊24 h 37.28±2.11 145.71±12.39a 174.39±8.33ab 414.446＊＊72 h 36.75±3.29 114.73±4.90a 135.02±6.33ab 647.534＊＊组别Sham组I/R组Bru组F IL-1β蛋白8 h 23.11±2.35 30.30±2.22a 40.23±2.83ab 71.973＊＊24 h 21.96±0.78 76.02±4.39a 97.45±4.60ab 664.147＊＊72 h 21.91±1.22 48.30±1.59a 69.92±2.25ab 1 145.327＊＊

3 讨论

缺血性脑卒中是由于脑局部血流中断，脑组织的供氧和葡萄糖的供应发生障碍，从而导致局灶性脑组织缺血坏死或软化及相应的神经功能缺损表现。其发病率高、致残率高、复发率高、死亡率高，且近年来发病人群趋于年轻化［8］。目前，对于缺血性脑卒中的治疗，公认有效的是在急性治疗时间窗内进行溶栓治疗。然而，溶栓治疗后血管再通的同时会发生缺血再灌注损伤，进一步加重脑损伤。脑缺血再灌注后，脑组织细胞会发生一系列复杂的损伤级联反应，包括线粒体能量代谢障碍、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、血脑屏障破坏等［9-11］。其中，炎症反应被认为是脑缺血再灌注损伤的重要病理机制之一［12］。因此，深入研究新的神经炎症机制、探寻新的重要的治疗靶点及其调控机制十分必要。

Nrf2属于转录因子亮氨酸拉链转录激活因子家族成员。在正常生理条件下，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）相结合，在泛素蛋白酶体系下迅速降解，从而维持Nrf2 的稳定以及低水平表达［13］。当氧化应激损伤或有外来刺激时，Nrf2 与Keap1 迅速解离，转位至细胞核内与抗氧化反应元件（ARE）上的特异位点结合，诱导抗氧化剂和解毒酶及下游相关蛋白的表达，从而发挥其效应［14］。Nrf2在维持大脑的正常生理过程中非常重要。小鼠Nrf2 基因敲除会导致蛋白酶体功能障碍，神经元凋亡，与年龄有关的前脑萎缩和神经行为缺陷，以及脑中多巴胺和5-羟色胺代谢产物水平升高［4］。近年有学者及笔者的前期研究表明，Nrf2 参与了脑缺血再灌注损伤过程，且具有内源性神经保护作用［15-17］。脑缺血再灌注后Nrf2 的表达明显上调，且梗死周围区Nrf2 表达水平明显较中心坏死区更多［18］，推测与梗死周围区的氧化应激程度更重有关［19］。与野生型小鼠相比，Nrf2 基因敲除小鼠进行短暂性大脑中动脉栓塞造模后，其抗氧化酶和解毒酶的基础活性和诱导活性均降低，脑梗死面积更大，行为学表现也更差［20］。本研究结果显示，Nrf2受抑制后，脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能缺损症状和脑组织病理损伤程度均明显加重，脑梗死面积也显著增加，进一步证实Nrf2在脑缺血再灌注损伤中有确切的内源性神经保护作用。本研究还发现，Nrf2 受抑制可显著上调促炎细胞因子IL-1β和IL-18的表达水平，加重缺血侧脑组织病理损伤，表明抗炎效应是Nrf2 发挥内源性神经保护作用的重要机制之一。

炎症小体是固有免疫系统最重要的组成部分之一，在各种炎症相关神经系统疾病的发病机制中起重要作用［21］。AIM2 炎症小体由 AIM2、Caspase-1 和一种称为ASC 的衔接蛋白构成。当模式识别受体AIM2 感知到损伤相关分子模式时，就会募集ASC，而ASC 则会募集Caspase-1，导致AIM2 炎症小体的激活。研究证实，AIM2炎症小体介导脑缺血再灌注后的脑损伤［2，22］。脑缺血再灌注后，AIM2 炎症小体活化，使无活性的pro-Caspase-1 转化为有活性的Caspase-1。Caspase-1 可剪切 pro-IL-1β 和 pro-IL-18，形成有活性的IL-1β 和IL-18，进而招募其他炎性细胞，放大炎症反应，加重缺血性脑损伤［23］。AIM2炎症小体可以在缺血损伤大脑的神经元、小胶质细胞及血管内皮细胞中检测到［24-25］。脑缺血再灌注后大鼠脑内AIM2 炎症小体信号转导关键成分AIM2、ASC、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的表达水平显著升高［3］。研究表明，组蛋白脱乙酰化酶3（HDAC3）的选择性抑制剂可通过抑制小胶质细胞中AIM2炎症小体的激活来减轻炎症反应，保护缺血性脑损伤［3］。此外，有研究发现AIM2 基因敲除后，脑缺血再灌注损伤小鼠的缺血侧脑组织中的AIM2及IL-1β 蛋白表达出现下调，脑梗死面积及神经功能缺损症状显著改善［4］。本研究结果显示，Nrf2 受抑制后，缺血侧脑组织中的AIM2炎症小体关键组分AIM2、ASC、caspase-1及促炎细胞因子IL-1β和IL-18的表达水平显著上调，脑组织病理损伤明显加重，表明AIM2 炎症小体及炎性介质均参与了脑缺血再灌注损伤过程，对脑缺血再灌注损伤有着重要的影响。

越来越多的证据表明，Nrf2 与炎症小体之间存在着交互作用。许多与炎症相关的不同疾病模型中，Nrf2 激活与NLRP3 炎症小体受抑制之间均存在相关性，例如，在急性肺损伤［26-27］、脑出血后脑损伤［28］、蛛网膜下腔出血后早期脑损伤［29］以及脑缺血再灌注损伤模型［30-32］中，Nrf2 的激活会抑制NLRP3炎症小体，从而抑制炎症反应。然而，Nrf2 对AIM2炎症小体是否存在调控作用尚不清楚。本研究结果显示，Nrf2 受抑制后，缺血侧脑组织中AIM2 炎症小体关键组分AIM2、ASC、Caspase-1 及促炎细胞因子IL-1β 和 IL-18 的表达水平显著上调，表明 Nrf2 对AIM2炎症小体具有负性调控作用。

综上，本研究进一步验证了Nrf2 具有确切的内源性神经保护作用，并证实其保护作用的机制可能与Nrf2负性调控AIM2炎症小体，进而减少促炎细胞因子的释放，减轻神经炎症反应有关。本研究为临床治疗缺血性脑卒中提供了治疗靶点及实验依据。