精子sncRNAs在环境暴露相关跨代遗传中的作用

华敏敏， 施惠娟， 茹彦飞

(1)上海市生物医药技术研究院，国家卫生健康委员会计划生育药具重点实验室，复旦大学， 上海 200032； 2)西湖大学生命科学与生物医学浙江省实验室，浙江省结构生物学研究重点实验室/浙江省生长调控和转化研究 重点实验室，生命科学学院， 杭州 310024)

精子是一类高度特异化的细胞，它的发育起始于睾丸中的原始生殖细胞，经历一系列复杂的精子发生过程，最终在附睾中发育为成熟精子。成熟精子经由受精过程与卵子结合，在将父源性的遗传信息传递给子代的同时，还会传递大量的表观遗传信息，包括DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA等，这些信息的改变并不依赖于DNA序列的变化。表观遗传信息与遗传信息一起，共同参与了受精过程及早期胚胎的发育，并可能最终影响子代的健康[1-4]。

依据已有的发育生物学及流行病学数据，环境因素可能是影响子代健康的重要因素[5]。从蠕虫到哺乳动物，包括人类，亲本的生活环境可影响子代的健康[6, 7]。Anway等[8]最先证明，对孕期大鼠进行环境因素——内分泌干扰物(vinclozolin)——的暴露可导致子代雄性大鼠睾丸DNA甲基化水平发生改变，同时引起精子质量的下降，且这些改变可持续至F4代。另有在人群样本中研究发现，吸烟以及营养状况的改变可导致可遗传的健康变化。例如，子代较易出现糖尿病和心血管疾病等[9, 10]。此外，来自不同实验室的研究均表明，环境暴露包括高脂饮食(high fat diet, HFD)[1, 11]、低蛋白饮食(low protein diet, LPD)[4]和心理压力[12, 13]等，可引起父代表型变化，并可通过父代生殖系统以非孟德尔遗传的方式传递给后代。以上结果均提示，环境暴露可能引起亲本生殖细胞(精子或卵子)表观遗传信息的变化，从而影响自身的发育与健康。虽然这种环境暴露不直接作用于子代，但其产生的获得性性状可通过生殖细胞传递给子代，同时对子代的健康产生影响，这种现象即被称为跨代遗传[14, 15]。

对于哺乳动物而言，遗传是一个复杂的调控过程，从雄性表观遗传学角度，验证跨代遗传有一定的挑战性：首先，配子经过表观遗传重编程，并通过受精过程，实现表观遗传信息的传递。其次，血睾屏障的存在阻碍了体细胞与生殖细胞之间的生物信息交流(乃至子代)。此外，由于精子和卵子的体积相差悬殊，传统的遗传观点认为，与母系相比，父系对子代的贡献较为有限。但雌性环境暴露研究中遇到的困难在于，难以区分环境因素作用的对象是卵子还是胚胎[16]。相比之下，雄性环境暴露则相对简单，主要通过精子影响子代。因此是研究跨代遗传相关机制的较为理想的模型[17]。

传统观念认为，许多新陈代谢相关疾病(例如糖尿病)既与遗传相关，也与患者的生活方式及环境相关，仅部分与遗传变异相关。但越来越多的研究证实，表观遗传在其中发挥一定的作用。因此，理解跨代遗传的可能机制，可为研究人类相关疾病奠定基础。本综述主要讨论哺乳动物中的雄性相关的跨代遗传，并重点探讨精子小非编码RNAs(small noncoding RNAs, sncRNAs)作为表观遗传调控因子，在跨代遗传中的可能机制。

1 雄性环境暴露相关的跨代遗传

亲代经历的特定环境暴露可影响子代健康。该现象最早是通过人群中的流行病学调查得出的。例如，有研究发现，1944～1955年间荷兰大饥荒时期，母亲在怀孕期间遭受饥饿可导致孩子新陈代谢相关疾病的比例显著增加[18]。男性方面，2006年Pembrey等[10]研究发现，父亲若有早年吸烟史，其儿子青少年时期的身体质量指数(body mass index, BMI)较高。对来自瑞典Overkalix地区的人群进行连续3代观察的研究显示，祖父的饮食习惯与其孙辈的健康状况及其死亡率相关[9]。

大量动物实验同样表明，父代环境暴露可影响子代表型。在饮食相关暴露中，父代高脂饮食(high fat diet，HFD)将导致F1代雌鼠葡萄糖不耐受[19]。父代低蛋白饮食(low protein diet，10vs.19 %蛋白质饮食，根据体重计算)会导致子代肝中胆固醇合成异常[20]。对雄鼠在交配前进行饥饿处理，将导致其子代血糖水平降低[21]。还有研究显示，父代的心理压力会提高子代的压力敏感性，同时子代皮质醇水平及葡萄糖代谢出现异常[6, 12, 22]。近几年，也有许多关于毒性物质暴露的相关研究。例如，在四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)导致雄性大鼠肝损伤的模型中，其子代肝脏的成纤维细胞减少[7]；若对雄性小鼠进行乙酰苯气味暴露，其所产子代同样会对该物质敏感[23]；父代尼古丁暴露后，子代对尼古丁以及其他有毒物质(例如可卡因)的代谢耐受提高[24]。同时，子代肝脏中多个与有毒物质清除相关的基因表达水平升高，且子代对毒性物质的耐受表型将不仅仅局限于尼古丁相关，而是广谱耐受。值得注意的是，在大多数研究中，父代环境暴露相关的跨代遗传表现为子代对疾病的敏感性升高。

2 精子传递表观遗传信息

精子核具有高度压缩的致密结构，体积约为普通体细胞的1/6。随着受精过程的完成，父代表观遗传信息可通过精子传递至受精卵，乃至子代[17]。在这个漫长的过程中，组蛋白被鱼精蛋白替换，精子细胞DNA本身及其相关蛋白质发生了表观遗传修饰。例如，DNA甲基化、组蛋白修饰，以及sncRNAs调控等。它们共同作用，改变了精子中的表观遗传信息，在精子染色质重塑、合子、胚胎、胎儿乃至子代的发育过程中发挥重要的作用。

目前，关于“精子传递表观遗传”的观点尚存在争议，主要是因为合子与原始生殖细胞(primary germ cell, PGC)中存在表观遗传重编程。这其中，包括2个独立的阶段：从PGCs发育至胚胎性腺(E10.5-E12.5)，以及受精后的合子到胚胎植入前的桑椹胚阶段。该过程可擦除大部分环境暴露所产生的表观遗传标记。DNA甲基化产生的m5C，由DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)催化，可通过脱氨基或是羟基化作用，实现脱甲基化[25]。有研究表明，环境暴露后，精子DNA甲基化的类型发生变化，但这些DNA甲基化的改变在其后代中检测不到[26]。表观遗传重编程还包括组蛋白修饰的擦除，在精子形成过程中，组蛋白H4高度乙酰化为组蛋白被鱼精蛋白替换提供基础；同时，这种重编程对维持精子功能至关重要。有研究表明，线虫中的H3K4me2去甲基化酶LSD1/KDM1对组蛋白的作用，可避免将错误的信息传递给后代[27]。此外，值得注意的是印迹基因的保留，意即其在受精后可逃逸重编程，并将特定的父代表型，以及异常的甲基化印迹通过精子传递给子代，这些印迹基因对胚胎及其组织器官的发育有着深远的影响[28]。一项关于辅助生殖技术(assisted reproductive technologies, ART)的研究表明，不育(尤其是少精症)患者的精子，在ART治疗过程中可将印迹基因错误地传递给子代，并导致后代的健康风险升高[29]。以上研究结果提示，精子中可能存在表观遗传信息的传递，能够逃脱表观遗传重编程，参与跨代遗传。近年来，关于精子sncRNAs在哺乳动物跨代遗传中的研究越来越多，提示它们或许会作为重要的表观遗传调控因子参与其中。本综述主要就该部分内容展开讨论。

2.1 精子小非编码RNAs

sncRNAs，长度< 50 nt，是调控基因表达的表观遗传因子之一，可以通过与翻译机器相互作用和/或通过降解其靶mRNA(message RNA)发挥功能。随着实验方法与技术的发展，例如高通量技术及RNA测序技术(RNA sequencing, RNA-seq)，人们在哺乳动物成熟精子中发现及鉴定到大量精子sncRNAs，主要为tRNA来源的小RNAs(transfer RNA-derived small RNAs，tsRNAs，也被称为tRFs，tRNA fragments)，其次为rRNA来源的小RNAs(risbosome-RNA derived small RNAs, rsRNAs)与微RNA(microRNAs, miRNAs)，及PIWI蛋白相互作用RNAs(PIWI-interacting small RNAs, piRNAs)等[30-33]。

精子sncRNAs重要成员之一是tRNA来源的小RNAs，或被称为tRNA fragments(tRFs)(29～34 nt)，主要来源于成熟tRNA或是pre-tRNA的5′-端，在许多细胞类型中均有表达，在精子细胞中表达尤其丰富[1, 4, 30, 31]。通过小鼠精子RNA-seq分析发现，它在成熟精子中表达比例最高，是成熟精子sncRNAs的主要组分，但是目前其功能尚不十分明确[31]。在其他哺乳动物(例如人类与大鼠)成熟精子中，同样表达大量tsRNAs[34]。tsRNAs可根据其在tRNAs的来源分为5类[35]：5′-tRNA halves、3′-tRNA halves、5′-tRFs(tRNA-derived RNA fragment)、i-tRFs(internal tRFs)及3′-tRFs。tsRNAs最初被认为是tRNAs的随机降解产物。最近的研究显示，tsRNAs的生成是被高度调控的过程，具有一定的位点特异性，在某些细胞中来源于一些特定的tRNAs类型[36]。在缺少辅助生殖技术的情况下，将精子sncRNAs用T4多核苷酸激酶(polynucleotide kinase，PNK)处理后，环磷酸盐从RNA的3′-端脱落，从而可以复制这些RNA序列，使得tsRNAs的表达水平升高。这表明，在雄性生殖系统中，RNaseA和/或RNase T家族内切酶参与tsRNAs的加工过程[37]。tsRNAs可在转录水平、转录后水平以及翻译水平调控基因的表达[38]。tsRNAs在精子中的相关功能目前尚不清楚，推测不同类型的tsRNAs可能通过不同的作用机制发挥作用。

rsRNAs是新近发现的一类在成熟精子中大量表达的sncRNAs，来源于rRNAs的5′-端部分。在RNA聚合酶Ⅰ(RNA polymeraseⅠ, PolⅠ)的作用下，由前体rRNAs(45S pre-rRNAs)转录而来，并最终生成一系列的rsRNAs，包括18S、5.8S、28S rsRNAs[39]。在哺乳动物中，rRNAs基因(rDNAs)由许多重复序列(nucleolar organizer regions, NORs)成簇组成，中间有间隔序列(long intergenic spacers, IGSs)，可通过改变转录频率或是转录本基因拷贝数来调控rRNAs的生成，例如改变DNA甲基化水平、组蛋白修饰、核小体的位置等方式激活/沉默rRNAs的转录与表达，从而影响生物体的发育与分化[39]。目前研究表明，成熟精子中的rsRNAs主要来源于28S，称之为rsRNA-28S，约为21～45 nt，其主要在小鼠附睾尾部成熟精子中大量表达[30, 40, 41]。此外，在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的急性炎症小鼠精子中，rsRNA-28S大量表达，表明其高表达可能和炎症反应相关[40]。由于目前关于精子rsRNAs的研究才刚刚起步，其在精子细胞中的表达及功能还有待进一步的探索。

miRNAs是目前研究较多的一类精子sncRNAs。其特征为具有发卡结构，长度约为22 nt。miRNAs来源于几百个带有发卡结构的核苷酸转录本，转录形成pri-miRNAs(primary miRNAs, pri-miRNAs)后，在RNase Ⅲ Drosha的作用下产生miRNAs前体(precursor miRNAs, pre-miRNAs)。pre-miRNAs含有1个发卡结构，长度约为70～100 nt，这些pre-miRNAs在输出蛋白5(exportin 5)的帮助下出核进入胞质，在胞质中由RNase Ⅲ Dicer切割形成成熟miRNAs。成熟miRNAs与Argonatue(Ago2)形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)，通过碱基互补配对定位于靶mRNA的3′-非编码区(3′-untranslated region, 3′-UTR)，最终导致靶mRNA降解或是翻译抑制，从而在表观遗传水平下调基因的表达[42-46]。值得注意的是，miRNA-mRNA是一个较为复杂调控网络，一个miRNA可以靶向许多mRNAs；同时，1个mRNA也可以被许多miRNAs调控。

piRNAs也是精子细胞中时空特异性表达的一类sncRNAs。成熟的piRNAs由长的单链转录本切割产生，长度为24～32 nt，主要成簇分布在长度在20～90 kb的基因簇上。piRNAs的来源主要为：基因组中的piRNA簇或转座子区域、内含子及外显子序列。piRNAs具有以下特性：可特异性地与PIWI家族蛋白质成员相互作用，5′-末端具有很强的U碱基偏好性；3′-末端被2′-O-Me修饰，以保护其免受核酸外切酶降解[47]。在哺乳动物中，piRNAs生成途径主要有2种：初级生成途径和次级生成途径[48]。目前认为，PIWI/piRNA主要具有沉默抑制基因组遗传元件，调控基因表达，调控蛋白质翻译及蛋白质稳定性等作用[49, 50]。研究发现，在mili缺失突变的小鼠睾丸中，L1 elements的甲基化水平明显下降，表明piRNAs可能参与介导了L1 elements的甲基化修饰[51]。piRNAs还能通过序列不完全互补配对识别靶mRNA，以一种类似miRNA的机制介导其翻译抑制，在小鼠精子发育后期mRNA大规模清除[50]。此外，小鼠PIWI/piRNA还能通过与翻译起始因子eIF3F相互作用，介导精子发育中huR结合的mRNA翻译[49]等。目前仅在线虫中发现了piRNAs介导的环境暴露相关跨代遗传现象[52]，Rechavi等[53]发现，在饥饿情况下，线虫piRNAs生成增加，营养相关基因表达发生变化，且变化可持续至F3代。Belicard 等[54]研究发现，提高线虫的培养温度(从20 ℃提高至25 ℃)，piRNAs的生成将会减少，并可导致基因表达变化，该变化同样可持续至F3代。在同样的培养条件下，病菌感染则会使线虫piRNAs生成的增加，子代的健康状况也得到了一定程度的恢复。但哺乳动物中相关研究报道则较少。

2.2 精子sncRNAs介导的跨代遗传

首次证明精子RNAs可以影响子代表型的研究是在小鼠模型中进行的副突变相关研究。在该研究中发现，在Kit(酪氨酸激酶受体)转基因的纯合雄性小鼠所产生野生型后代中，具有和其父代一样的表型(尾颜色发生变化，呈白色)。若将Kit突变小鼠纯化的精子RNAs通过显微注射进野生型受精卵，可将父代白尾的突变表型传递给子代[55]。该团队还发现，若分别将靶向Cdk9和Sox9的RNAs同样显微注射进野生型受精卵中，这2个基因的表达水平会升高，并引起严重的表型变化(分别是心肌肥大和巨人症)[56]。越来越多的研究证明，sncRNAs是精子中重要的表观遗传因子，它们可能参与调控跨代遗传。

动物模型方面，目前研究较多的环境暴露是饮食暴露[57]。低蛋白质或是高脂饮食小鼠的成熟精子中sncRNAs表达水平发生变化。雄鼠给予低蛋白质饮食暴露后，其雄性子代可产生与父代类似的肝的胆固醇生物合成异常，精子中5′-tsRNAs(5′-端tRNA来源的tsRNAs)，例如tRF-GlyGCC、tRF-GlyTCC、 tRF-GlyCCC(均为解码甘氨酸的tRNA来源的5′-tsRNAs，GCC、TCC、CCC为tRNA的反密码子，下同)，tRNA-LysCTT以及tRNA-HisGTT的表达水平上调，miRNA(let-7c)表达下调[4]；Carone等[20]对父代低蛋白质饮食暴露的小鼠子代的肝细胞进行基因组测序，发现子代胆固醇及脂质代谢相关基因的表达发生改变，其表观遗传修饰发生改变，例如胞嘧啶甲基化修饰，多个miRNAs的表达水平(例如miR-210、let-7a、let-7f-1、let-7f-2、miR-21、miR-98、miR-199)也发生变化。另有研究表明，高脂饮食暴露将导致雄性小鼠精子tsRNAs表达水平整体升高。同时，将小鼠精子tsRNAs通过显微注射进野生型受精卵，子代将产生和父代类似的新陈代谢表型。这表明，tsRNAs可以作为父代饮食暴露相关的表观遗传信息传递者[1, 41]。在大鼠中，高脂饮食暴露同样可改变精子中一些sncRNAs的表达，包括piRNAs(piR-025883, piR-015935, piR-036085)，miRNAs(let-7c, miR-293, miR-880)以及tRNA-GluCTC[58]。Cropley等对雄性小鼠进行西方饮食(western diet)暴露，父代小鼠具有肥胖及糖尿病前期病症表型，所产F1、F2代雄性小鼠即使给予健康饮食，其新陈代谢仍表现异常。进一步研究发现，F1子代小鼠精子中，多个sncRNAs表达发生变化，例如miR-10a、miR-10b表达显著上调，tRNA-GlyGCC、tRNA-GluCTC表达水平明显降低[11, 59]。若将这些雄性小鼠精子或是睾丸中RNAs显微注射进正常受精卵中，则所产子代可重现这些表型。有趣的是，研究发现，若在野生型受精卵中注射单一的miRNA(miR-19)即可在子代中实现表型重现；该子代和正常雌鼠交配后，部分代谢异常表型在其后代(subsequent generations)中仍会出现[11]。以上研究均表明，精子sncRNAs参与了环境暴露导致跨代遗传，尤其是tsRNAs与let-7较易受饮食影响而发生表达变化。

心理压力同样会导致精子sncRNAs表达水平变化，例如早期生活创伤或是慢性压力等。由于多种神经系统疾病与下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA轴)相关，例如精神分裂症和抑郁症等[60]。因此，心理压力也可能对生殖系统产生影响。有研究表明，父代遭受长期压力应激后，小鼠精子中9个miRNAs表达发生显著变化，同时子代HPA轴应答迟缓[12]。研究进一步将这9个miRNAs混合后，显微注射到正常受精卵中，所产子代同样表现为HPA轴失调[13]。另一项研究表明，通过给交配前的雄性小鼠(F0代)持续4周服用含有糖皮质激素(corticosterone, CORT)的水来模拟应激状态下父代小鼠的生理变化，尽管糖皮质激素并不产生父代小鼠的焦虑行为，但其F1雄性小鼠具有类似的焦虑行为，F1雌性小鼠则表现为恐惧消失。有趣的是，父本印记基因Igf2的表达在F1雄性后代参与应激的大脑海马中表达增加，但在雌性后代海马中则表达下调。糖皮质激素组F2代雄性和雌性小鼠均表现为焦虑程度降低，但只有糖皮质激素组F2雄性小鼠抑郁行为增加；与对照组相比，糖皮质激素组后代精子中，大量sncRNAs表达发生变化，其中主要为miRNAs。其中，3种miRNAs(miR-98、miR-144和miR-190b)表达水平升高，预测它们可能与多种生长因子(包括Igf2和Bdnf)相关[61]。在创伤性压力小鼠模型中，雄性小鼠暴露于母子分离所带来的早期生活压力(maternal separation coupled with unpredictable maternal stress, MSUS)，此类压力现象可传递给子代(F1、F2代)，使其行为学以及新陈代谢发生异常，且F1代小鼠精子中miRNAs表达水平上调，piRNAs表达下调。值得注意的是，在F2、F3代中，虽然具有类似的表型，但精子sncRNAs表达水平则未见明显变化。若将父代小鼠精子sncRNAs显微注射进正常受精卵中，所产子代与父代的表型类似[6]。此外，进一步的研究显示，父代早期生活创伤可影响精子sncRNAs以及长非编码RNAs(long non-coding RNAs, lncRNAs)，通过显微注射的方式，分别将sncRNAs与lncRNAs注射进正常受精卵，产生的子代具有不同的表型，sncRNAs组表现为体重异常，抑郁倾向；lncRNAs组表现为新陈代谢异常，较为焦虑[62]。以上研究表明，压力和应激水平的变化可以改变精子sncRNAs表达水平，并且这些变化可能影响后代的表型。

毒性物质暴露也可产生跨代遗传。例如，雌性大鼠孕前vinclozolin(乙烯菌核利，一种农药)暴露可导致子代大鼠生精细胞凋亡，肾组织异常等，其F3代雄性大鼠具有类似表型，且精子中大量sncRNAs表达发生变化，其中变化最多的是tsRNAs中的5′-halves[63]。若对雌性小鼠孕前进行DDT(杀虫剂)暴露，其表型(例如肥胖)可在子代雄鼠中重现，并可传递至F3代。其中，每一代小鼠精子的DNA甲基化水平、sncRNAs表达水平均发生显著变化[64]。若父代雄鼠长期酒精暴露，可增加子代雄鼠的酒精耐受以及子代雌鼠的焦虑情绪；同时，通过高通量测序发现，子代精子中tsRNAs、线粒体小RNA以及miRNAs的表达水平发生变化；精子sncRNAs的转录后修饰受到影响，线粒体tRNAs中2种核苷修饰增加，附睾中tRNA甲基转移酶NSun2表达水平降低[65-67]。由于NSun2是一种5′胞嘧啶甲基的生成酶[68]，因此推测酒精暴露可能影响tsRNAs的表达。

另有其他一些暴露同样可导致跨代遗传。例如有研究发现，雄鼠感染弓形虫后，精子的密度和活动力等均有显著降低，行为学实验显示大脑受损，神经精神行为异常，精子sncRNAs表达水平也发生显著变化，其F1、F2子代同样具有类似表型；同时，若将父代雄鼠精子sncRNAs通过显微注射进野生型受精卵，所产子代也具有部分类似表型[69]。另有一些暴露对机体有良性促进作用。例如，体育锻炼与认知训练可增加小鼠大脑突触可塑性，并且该现象会传递给子代；进一步通过显微注射实验发现，该现象可能是通过精子sncRNAs介导的，尤其是miRs-212/132在其中发挥了重要作用[70]。

综上所述，许多研究证实，环境暴露可影响精子sncRNAs的表达(Table 1)。例如，饮食暴露主要影响tsRNAs与let-7表达，压力主要影响miRNAs表达等。此外，值得注意的是，由于环境暴露种类和暴露时间的不同，可能会导致不同的表观遗传因子在其中发挥主要作用。例如，小鼠从出生到断奶期间进行低蛋白质饮食暴露，精子中rDNAs(ribosomal DNAs)的DNA甲基化水平发生变化[71]；然而，若小鼠从断奶开始低蛋白质饮食暴露，其中sncRNAs的表达水平发生变化，但是rDNAs的甲基化水平则未见发生明显变化[4, 72]。其中具体的作用机制仍有待进一步的研究。

2.3 环境因素影响精子sncRNAs的可能机制

父代环境因素是如何影响配子表观遗传信息以及子代表型的？如上所述，许多研究证实，父代环境因素可影响精子sncRNAs水平；然而，研究人员对于环境暴露是如何影响精子sncRNAs表达的仍知之甚少。已有研究显示，父代环境因素可能通过以下途径影响精子sncRNAs表达。

环境暴露可能直接影响sncRNAs表达。临床研究表明，在创伤后的压力失调及抑郁症倾向人群中，其血液中的Dicer1表达水平降低，而压力刺激相关的大脑杏仁体活性升高[73]。Dicer1是RNase III 核酸内切酶，参与经典miRNAs生成途径[74]。它在精子发生和维持男性生育力中发挥作用，在雄性小鼠原始生殖细胞(primary germ cells, PGCs)中条件性敲除Dicer1，可导致雄性子代PGCs生成异常，精子发育阻滞在圆形精子阶段[75, 76]。Dias等[77]发现，小鼠大脑伏核区的Dicer1可能参与下游β-catenin/Wnt信号通路，在长期恐惧压力下的小鼠中，若将Dicer1敲除，压力相关表型随之消失。有研究表明，长期压力下，小鼠神经元细胞氧化应激水平升高，并可通过影响Dicer1的活性，抑制miRNAs的生成，导致miRNAs的表达水平降低[78]；而同时有研究表明，原发性不育症患者体内，其氧化应激水平通常较高[79]。在精子中，Dicer1是否也发挥类似功能，有待更多的研究。

精子sncRNAs也可通过膜泡(extracellular vesicles, EVs)或类似结构进入精子。最近研究发现，附睾小体(epididymosomes, EPs)中有miRNAs与tsRNAs表达，这些sncRNAs可以通过附睾小体与精子的相互作用，从而迁移到精子中。说明附睾可以作为环境感知器官，将这些信息通过膜泡以sncRNAs的形式传递给成熟精子，从而影响子代的表型[15, 80-83]。父代酒精暴露小鼠模型中，附睾小体中tsRNAs变化与精子中的变化类似，提示精子中sncRNAs可能来源于附睾小体[65]。有研究发现，肥胖及精神压力可引起炎症[84, 85]，在高脂饮食暴露导致的肥胖[86]，或心理应激情况[87]下，小鼠血睾屏障破坏，体细胞膜泡加速迁移至发育的生精细胞与精子细胞。在上文中提到的酒精暴露小鼠中，附睾中NSun2表达水平的降低，可导致附睾小体中tsRNAs水平升高[65]。研究进一步将正常小鼠精子与酒精暴露组的精子附睾小体共孵育，并通过IVF(invitrofertilization)产生子代，发现子代同样具有父代焦虑表型，并对酒精的敏感度降低。该研究表明，附睾中的附睾小体可将酒精暴露引起的表型传递给子代[66]。此外，精液样本中含有大量微生物[88]，可以释放与附睾小体类似的膜泡，并有可能给改变精子中sncRNAs表达水平[89]。因此，含有sncRNAs的膜泡作为迁移载体，可介导精子-精子和/或雌性-精子信息交流。类似的研究有望建立新的环境因素相关的进化机制。

Table 1 Selection of studies providing evidence of transgenerational inheritance of sperm sncRNAs in murine models

环境暴露还可能影响精子sncRNAs的迁移。游离于膜泡外的体液中的sncRNAs可通过结合蛋白质，具有特殊的二级结构，或是特定的RNA修饰，从而稳定存在[90, 91]，并在细胞间进行迁移。有研究发现，特定的5′-tsRNAs可具有G-4偶联体结构，从而参与神经保护应答。有趣的是，含有G-4偶联体结构的tsRNAs会被神经元细胞吸收[92]。这表明，该特殊结构可促进sncRNAs的跨膜运动。该现象意味着，虽然大多数血清中的tsRNAs都是以游离形式存在于膜泡外，但它们或可通过特定的结构(例如G-4偶联体)，从而进入精子细胞，实现sncRNAs的迁移，为sncRNAs表达变化提供了新的研究方向。

染色质结构的重塑也会影响sncRNAs的表达。成熟的精子中包含许多mRNAs与sncRNAs[93]。最近，通过过表达赖氨酸特异的组蛋白脱甲基酶1(lysine-specific histone demethylase 1，LSD1)转基因小鼠，可以观察到，父代LSD1过表达会影响子代的发育，而后代生殖细胞系中该基因的表达缺失，但缺陷表型仍然存在[94]。这些转基因导致的缺陷并不能通过CpG岛DNA甲基化水平变化而传递，而是与子代正常精子中的异常RNAs表达水平相关。推测精子RNAs表达异常可能导致子代表型缺陷。这有可能是由于异常表达的精子RNAs导致的染色质结构变化，并反过来影响RNAs表达。目前，在线虫中已发现类似的RNA依赖的反馈调控机制[52, 95]，而在哺乳动物中这一观点有待进一步证实。

3 问题与展望

越来越多的证据表明，在哺乳动物中，父代环境因素产生的影响可以通过精子传递给子代，sncRNAs则可能作为精子中环境因素相关的表观遗传因子，参与父源性的跨代遗传。目前，环境暴露相关动物研究主要集中在饮食暴露和压力应激等，对人类活动中较为常见酒精暴露和尼古丁暴露等则涉及较少。同时，关于精子sncRNAs在跨代遗传中的作用，仍有许多重要的科学问题待解决。例如，一种环境暴露是否影响某一类特定的表观遗传因子；不同的表观遗传因子之间是否存在相互作用；环境因素是通过何种方式影响精子中sncRNAs表达变化的？精子中sncRNAs表达水平的变化是如何影响受精卵，乃至子代健康的？随着单细胞组学技术的不断进步，可以对精子与胚胎的sncRNAs进行更为详细的鉴定分析，所涉及的相关机制也将得到深入探索，从而为研究跨代遗传的获得性表型提供思路，并通过结合人群流行病调查结果与临床数据，为人类生殖健康相关研究提供新的线索，为相关疾病(例如糖尿病)的诊断、靶向治疗及预后评估等提供分子靶点。