细菌纤维素/明胶复合止血海绵的制备与性能研究

2022-04-20吴擢彤王宝秀韩志良陈仕艳

合成技术及应用 2022年1期

万嘉，吴擢彤，王宝秀，韩志良，陈仕艳

(东华大学材料科学与工程学院，纤维材料改性国家重点实验室，上海 201620)

血液是人体的重要组成部分，在人体内起到运输营养物质和废物、调节人体渗透压和酸碱平衡、调节体温等功能[1]。研究表明，过度失血导致的死亡占全世界死亡率的30%[2]。因此，若是能够在救援人员到达之前使用高效的止血材料快速止血，减少伤者血液流失，其存活率可大大提高。

BC具有纯度高、可再生、生物相容性好等优良特性[3]，广泛应用于医用材料。由于BC具有很强的分子间氢键及高结晶度[4]，这使其具有良好的力学性能，如高拉伸强度和弹性模量[5]，可以应用于各种复合材料中提升其力学性能[6]。目前已有许多学者将其作为增强材料应用于聚合物复合材料的合成与制备中，得到了性能优异的复合材料[7]。明胶海绵是一种常见的医用止血材料，具有疏松的三维立体多孔结构，可以吸收伤口处的血液，自身体积膨胀对伤口进行机械压迫或填塞，达到止血效果，但明胶止血海绵的结构疏松，力学性能不好，用作敷料时创面的黏合能力不强[8]。

因此，本研究使用EPTAC对BC进行季铵化改性[9]，使BC可以通过阳离子凝聚血红细胞形成血栓促进止血，将其与明胶(Gel)进行复合制备止血海绵，以改善明胶海绵多孔结构带来的力学性能差的问题。在控制海绵良好的压缩性能以及吸水性能的同时，具有良好的抗菌性能。

1 试验

1.1 原料与试剂

BC，CP，上海奕方农业科技股份有限公司；EPTAC，RG，上海泰坦科技股份有限公司；氢氧化钠，AR，平湖化工试剂厂；异丙醇，AR，上海沃凯生物技术有限公司；无水乙醇，AR，上海凌峰化学试剂公司；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，AR，北京百灵威科技有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺，AR，sigma-aldrich有限公司；抗凝兔血，BR，河南巨石生物科技有限公司；明胶，CP，国药集团化学试剂有限公司；2-(N-玛琳代)乙磺酸，AR，国药集团化学试剂有限公司；戊二醛，BR，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器设备

场发射扫描电镜，S4800型，Hitachi公司；傅里叶红外光谱仪，Nicolet-670型，Spectrometer公司；纳米粒度仪，Malvern Instruments Ltd型，Malvern公司；紫外分光光度计，Evolution 201型，Spectrometer公司；电子万能材料试验机，Instron 5969型，Instron公司。

1.3 试验过程

1.3.1 纤维素季铵化

称取1 g BC(干重)加入10 mL去离子水和30 mL 异丙醇分散，再加入20 mL质量分数10%的氢氧化钠溶液，于65 ℃下加入9 g EPTAC，在磁力搅拌条件下反应10 h。将反应体系溶液多次高速离心，洗涤，得到季铵化BC，记为CABC。

1.3.2 复合海绵的制备

称取明胶溶解，与CABC混合，制备成固含量为2%的复合溶液，充分混合后脱泡，置于培养皿中冷冻干燥，制得不同比例的复合海绵，CABC与明胶的比例分别为4∶6、5∶5、6∶4。

1.3.3 复合海绵的交联

称取等摩尔量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于pH为5.5的0.5 mol/L的MES缓冲液和乙醇混合溶液中，MES缓冲液与乙醇体积比为3∶2，制得交联液。将复合海绵浸泡于之前配置好的交联液中，浸泡24 h后，用去离子水清洗直至完全去除交联液后冷冻干燥得到复合海绵。

1.4 分析测试

1.4.1 吸水率测量

将制得的复合海绵干燥称重，然后将其在去离子水中浸泡5 min，吸去表面水分后称重，根据公式计算其吸水率，公式如下[10]：

(1)

式中W为吸水率，%；M1为干燥样品质量，g；M2为充分浸湿样品质量，g。

1.4.2 孔隙率测量

将制得的复合海绵干燥称重，然后将其浸没于盛满乙二醇溶液的密度瓶中，除去气泡，再加满乙二醇，用滤纸拭去密度瓶表面的乙二醇并称重，取出样品称重，根据公式计算其孔隙率，公式如下[11]：

(2)

式中P为材料孔隙率，%；M1为干燥样品质量，g；M2为充分浸湿样品质量，g；M3为装满乙二醇的密度瓶质量，g；M4为装有样品和乙二醇的密度瓶质量，g。

1.4.3 凝血指数(BCI)测试

称取10 mg海绵，37 ℃恒温孵育，加入100 μL抗凝兔血和20 μL的0.2 mol/L的CaCl2溶液，5 min后加入25 mL蒸馏水，在37 ℃下以50 r/min的转速恒温摇匀，5 min后取出溶液，用紫外分光光度计测量其在波长545 nm下的吸光度值(abs)。设立不加入海绵作为对照组，BCI值计算公式如下：

(3)

式中abs样品为实验组的吸光度值，L/(g·cm)；abs对照为对照组的吸光度值，L/(g·cm)。

1.4.4 海绵的动态凝血测试

取10 mg海绵，37 ℃恒温孵育，加入100 μL抗凝兔血和20 μL的0.2 mol/L的CaCl2溶液，分别在0、5、10、15、20、25和30 min时加入25 mL蒸馏水，在37 ℃恒温50 r/min转速下，摇匀后取出溶液，用紫外分光光度计测量其在波长545 nm下的abs。

1.4.5 海绵的血细胞吸附测试

取抗凝兔血，2 000 r/min离心，移去上层血浆，下层的红细胞用PBS缓冲液稀释到原来浓度的10%，海绵置于24孔板中，在37 ℃恒温环境中孵育5 min，加入300 μL红细胞稀释液，在37 ℃恒温环境中孵育30 min后，用PBS缓冲液洗掉未被吸附的红细胞，用2.5%的戊二醛固定30 min，分别用40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液梯度洗脱15 min，最后样品自然风干，喷金处理后用扫描电子显微镜观察红细胞的吸附情况。

1.4.6 海绵的抑菌性能测试

分别将革兰氏阴性大肠杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌于37 ℃下，在培养基中培养24 h，然后取细菌悬液与样品在PBS缓冲液中震荡培养24 h，分别稀释100倍和1 000倍后均匀涂布于固体培养基上继续培养24 h，统计培养基上的菌落数，计算其抗菌率η[12]，公式如下所示。

(4)

式中N0为对照组菌落数，个；N1为实验组菌落数，个。

1.4.7 海绵的细胞毒性测试

将细胞置于加有海绵浸出液的培养基中培养24 h，然后使用CCK-8试剂对其细胞活性进行测量。计算公式如图所示[13]：

(5)

式中R为细胞存活率，%；abs样品为实验孔吸光度值(培养过细胞的培养基、CCK-8、待测物质)，L/(g·cm)；abs空白为空白孔吸光度值(未培养细胞的培养基、CCK-8)，L/(g·cm)；abs阴性对照组为对照组吸光度值(培养过细胞的培养基、CCK-8、不含待测物质)，L/(g·cm)。

1.4.8 其他测试

采用傅里叶红外光谱仪，溴化钾压片法对季铵化BC、纯BC、EPTAC进行FT-IR测试，设定波长范围为4 000～400 cm-1。

以去离子水为溶剂采用纳米粒度仪对季铵化BC进行Zeta电位测量。

采用场发射扫描电镜在加速电压为15.0 kV的条件下对样品的微观形貌和结构进行表征。

使用电子万能材料试验机测量样品的压缩模量及压缩循环，设定压缩速率为10 mm/min，最大压缩量为50%。

2 结果与讨论

2.1 BC季铵化改性及表面电性

EPTAC、BC、CABC傅里叶红外光谱图如图1所示。

图1 EPTAC、BC、CABC傅里叶红外光谱图

通过比较CABC与BC的红外光谱图可知，经过改性后的CABC与BC仍然存在相似的峰型，但在1 480 cm-1附近出现一个吸收峰，对应EPTAC的CH3振动峰[14]。

使用Zeta电位来评估CABC的表面电性，如图2所示。

图2 BC、CABC的Zeta电位图

从图2可以看出，所得CABC的Zeta电位为40 mV，与纯BC的Zeta电位-16.75 mV相比，季铵化改性后的BC带有一定量的正电荷，带同种电荷的CABC分子链产生相互排斥的静电力，避免了纤维素纳米纤维间的缠结发生，同时抵抗BC的重力使其均匀地分散在溶液中不发生沉降，这使得CABC在水中的分散性较好[15]。

2.2 吸水率和孔隙率分析

不同质量比的CABC/明胶复合海绵孔隙率、吸水率如图3所示。

根据不同比例的CABC/明胶复合海绵的孔隙率、吸水率关系图可以看出，随着CABC含量由40%增加至60%，复合海绵的孔隙率由83.4%下降至70.45%，这是由于BC的纳米纤维与明胶孔壁存在较强的界面作用力，随着CABC含量的增加，其作用力增强，CABC/明胶复合海绵的结构也越加紧密，导致孔隙率下降。

由于随着CABC含量的增加，复合海绵的孔隙率下降，其吸水率也由3 131%下降至2 463%，与孔隙率的变化趋势相同。通过纤维素纳米纤维的引入，可以调控明胶海绵的孔隙结构，从而控制止血过程中过多的血液流失，解决商用明胶海绵在临床应用过程中血液流失过多的问题。

2.3 海绵微观形貌观察

在扫描电镜下对不同比例的CABC/明胶复合海绵进行观察，结果如图4所示。

图4 不同质量比的CABC/明胶复合海绵表面SEM图CABC：明胶分别为4∶6(a、b)，5∶5(c、d)，6∶4(e、f)

从图4(a、c、e)中可以看到复合海绵表面具有若干片状结构堆叠，这使复合海绵具有一定的吸水性。当伤口出血时，复合海绵可以吸收流失的血液和组织液，发生轻微的膨胀压迫伤口组织多余的生物流体流失，并同时提供湿润的愈合环境。另外，从图4(b、d、f)中可以看出，海绵内部孔壁的表面附着了大量的纤维素纳米纤维，作为材料骨架为复合海绵提供了支撑作用，使其能够适应更为复杂的临床环境，而不至于塌陷变形。与单独的明胶相比，纳米纤维的引入提高了材料表面的粗糙度，提高了细胞的黏附[16]，使得复合海绵能够黏附更多的血浆和血细胞，促进血液的凝结[17]。随着CABC含量上升，复合海绵的孔径逐渐减小，纤维素纳米纤维也越发致密，这也是孔隙率和吸水率随CABC含量下降而略有下降的原因。

2.4 海绵凝血情况分析

对复合海绵进行全血凝血指数分析，结果如图5所示。

图5 CABC/明胶复合海绵全血凝血指数

BCI反应材料的凝血性能，其数值越小，材料的凝血效果越好。通过测量，不同比例的CABC/明胶复合海绵的BCI分别为15.8%、10.3%、13.7%，其中质量比为5∶5的复合海绵数值最低，证明其凝血性能最好。这是因为质量比为4∶6复合海绵结构松散，孔洞太大，难以实现血液的吸附固定，使血液无法快速凝结，导致BCI过高；而质量比为6∶4的复合海绵的结构致密，孔径较小，导致血液无法快速渗入海绵内部，只浮在海绵表面，无法促进血液凝结，导致BCI偏高。因此，质量比为5∶5的复合海绵BCI最小，凝血效果最好。

图6为CABC/明胶复合海绵动态凝血分析。

图6 CABC/明胶复合海绵动态凝血分析

通过动态凝血实验观察到在0～5 min内吸光度迅速下降，而后趋于平缓，这说明在5 min内复合海绵和纯明胶海绵都促进了血液的快速凝结，随着时间的增加，吸光度趋于平缓，这证明凝血过程基本完成。无论是何种比例的CABC/明胶复合海绵的吸光度都低于同时期的纯明胶海绵，证明CABC的引入可以促进血液的凝固，综合来看CABC与明胶质量比为5∶5的复合海绵凝血效果最好。

2.5 海绵的血细胞吸附

不同质量比的复合海绵的血细胞吸附SEM图如图7所示。

从图中可以看出，质量比为5∶5的海绵血细胞吸附最多；质量比为4∶6海绵由于结构松散，孔洞太大，血细胞难以吸附固定；质量比为6∶4的海绵结构致密，孔径较小，血细胞难以快速渗入海绵内部进行吸附固定，这与之前测量的全血凝血指数和动态凝血分析结果一致。

2.6 海绵的力学性能分析

对不同纤维素和明胶比例的复合海绵及明胶海绵进行了力学性能分析，应力应变曲线如图8所示。

从图8可以看出，与明胶海绵相比，复合海绵的压缩应力有了较大的提高，质量比为4∶6、5∶5、6∶4的复合海绵压缩模量(图9)分别达6.96、8.56和6.17 kPa，是明胶海绵的压缩模量(2.44 kPa)的3倍左右，这说明BC的引入对明胶海绵的三维多孔状结构起到了支撑作用，达到了力学增强的效果。

图9 不同质量比的复合海绵与明胶海绵的压缩模量图

选择力学增强效果最好的质量比为5∶5的样品，对其进行了压缩循环性能测试，如图10所示。

图10 CABC与明胶质量比为5∶5的复合海绵压缩循环图

从图10中可以看出，随着应变的逐渐增加，应力也逐渐增加。在释放压力后，海绵可以回复到初始状态。虽然在第一循环后应力稍微有点降低，但在随后的压缩循环中几乎保持不变，说明能够承受一定的变形，并具有良好的循环稳定性。

2.7 海绵的抑菌性能分析

对复合海绵进行了抗菌性能表征，如图11、12所示。

图11 复合海绵的抑菌实验a) 大肠杆菌对照组；b) 实验组；c) 金黄色葡萄球菌对照组；d) 实验组

图12 复合海绵对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率

从图11可以看出，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌来说，实验组的菌落数都显著少于空白对照组的菌落数，这证明其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有一定的抑菌性，其抑菌率分别为65.0%、87.6%(图12)这是因为N+阳离子的引入会与负电荷的细菌细胞膜表面产生静电作用，导致膜表面电荷分布不均匀，使得细菌丧失正常生理功能，从而导致细菌死亡。止血海绵优异的抗菌性给予了海绵更大的应用潜力，在伤口的止血过程中，预防伤口感染是不可避免的问题，传统的抗菌防感染的策略多是辅以药物和抗菌剂，但无形中提高了材料的制作成本和应用难度，而具有本征抗菌能力的CABC以及其制备的复合海绵很好地弥补了这一缺陷，并为抗菌海绵的制备提供了新的研究思路和指导意义。

2.8 海绵的细胞毒性评价

对不同比例的复合海绵进行了的细胞活性表征，如图13所示。

从图13可以看出，CABC与明胶比例为4∶6、5∶5、6∶4的复合海绵的细胞活性分别为100%、90%、87%，根据GB/T 16886.5—2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验要求，细胞活性下降大于30%被认为有细胞毒性反应。因此，可以认为制备的复合海绵无细胞毒性，具有用于生物体止血的应用基础。细胞活性随CABC含量上升而下降可能是因为接枝了阳离子的CABC在水中少量电离出阳离子对细胞活性产生影响。