高效液相色谱法同时测定复方硫酸新霉素滴眼液中7 种抑菌剂

2022-04-20陈再洁陈艳芝吴小梅薛昆鹏任兴发屠炳芳

中国药业 2022年7期

陈再洁，陈艳芝，吴小梅，薛昆鹏，任兴发，屠炳芳

（月旭科技<上海>股份有限公司，上海 201600）

复方硫酸新霉素滴眼液主要成分为硫酸新霉素、地塞米松磷酸钠、玻璃酸钠，其中硫酸新霉素为氨基苷类广谱抗菌药物，对革兰阴性菌、革兰阳性菌、抗酸杆菌和放线杆菌属都有抑菌效果，对葡萄球菌的作用比链球菌强，生物体液中的脓液、渗出液、胃肠分泌液、细菌生长产物和酶均不影响其抗菌作用；地塞米松磷酸钠为人工合成的糖皮质激素，具有较强的抗炎和抗过敏作用；玻璃酸钠是眼用制剂的载体，具有保湿、增稠、增强药物利用度、减少药物刺激等作用。其适应证为急、慢性结膜炎，巩膜炎，急性巩膜炎，角膜炎，葡萄膜炎，青光眼，白内障，角膜移植术后及眼部受伤后的处理。多剂量包装的滴眼液中通常加入了适宜的抑菌剂，以防止使用过程中被微生物污染。复方硫酸新霉素滴眼液被收载于《国家药品标准·化学药品地方标准上升国家标准（第三册）》［WS - 10001 -（HD - 0261）-2002］，注明“本品中可加适量的抑菌剂”，但对抑菌剂的具体种类和加入量未作规定，并非所有生产企业均使用相同的抑菌剂，部分生产企业也未在药品说明书中明确标示抑菌剂的含量。相关数据显示，收载的多个滴眼液品种仅部分列入抑菌剂含量测定［1］。目前尚未建立统一、规范的滴眼液常用抑菌剂的检测方法，不利于有效监管。为了更好地控制滴眼液的质量，本研究中建立了同时测定复方硫酸新霉素滴眼液中7 种抑菌剂含量的高效液相色谱（HPLC）法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Wisys 5000 型高效液相色谱仪（月旭科技<上海>股份有限公司），配有四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外- 可见分光光度检测器、色谱工作站；AUW120D 型电子分析天平（日本岛津公司，精度为十万分之一）；DHG-9123A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ-400E 型台式超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司，功率为400 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

复方硫酸新霉素滴眼液（武汉五景药业有限公司，批号分别为20050203，20050204，20060102，20060103，20060104，20060105）；羟苯甲酯标准品（批号为100444-201804，纯度为99.6%），苯甲酸钠标准品（批号为100433-201702，纯度为99.7%），羟苯乙酯标准品（批号为100847 - 201604，纯度为99.9%），羟苯丙酯标准品（批号为100444-202005，纯度为99.9%），苯扎溴铵标准品（批号为135051-202002，纯度为99.8%），均购自中国食品药品检定研究院；硫柳汞钠标准品（批号为12627 - 2001，纯度为99.5%），苯扎氯铵标准品（批号为12625-2001，纯度为99.5%），均购自上海赤芍生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：月旭Ultimate®XB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）- 磷酸水溶液（磷酸调pH 为3.5，B），梯度洗脱（0～8 min 时 40%B，8～19 min 时40%B → 90%B，19～27 min 时 90%B，27～28 min 时90%B → 40%B，28～35 min时40%B）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：214 nm；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

单标溶液：取羟苯甲酯、苯甲酸钠、羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴铵、苯扎氯铵标准品各适量，精密称定，分别置10 mL 容量瓶中，加水定容，超声（功率为400 W，频率为40 kHz）使溶解，得各标准品质量浓度分别为7.24，11.27，9.54，4.83，10.49，55.29，51.02 μg/mL的单标溶液。

混合标准品溶液：取羟苯甲酯、苯甲酸钠、羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴铵、苯扎氯铵标准品各适量，精密称定，置50 mL容量瓶中，加水定容，超声（功率为400 W，频率为40 kHz）使溶解，得各标准品质量浓度分别为62.5，101.5，108.0，53.5，121.0，535.0，496.5 μg/mL的混合标准品贮备液；精密量取上述混合标准品贮备液1 mL，置10 mL 容量瓶中，加水定容，混匀，即得各标准品质量浓度分别为6.25，10.15，10.80，5.35，12.10，53.50，49.65 μg/mL的混合标准品溶液。

供试品溶液Ⅰ：取样品 5 支，混匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得硫酸新霉素和地塞米松磷酸钠质量浓度分别为3.5，1.0 mg/mL 的供试品溶液Ⅰ。样品说明书中若标注了抑菌剂，根据标示量用水适当稀释，将其质量浓度稀释至线性范围内。本研究中的样品均未标注抑菌剂信息。

供试品溶液Ⅱ：取样品5 支，混匀，取5 mL，加入混合标准品贮备液2 mL，置10 mL容量瓶中，用水定容，羟苯甲酯、苯甲酸钠、羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴铵、苯扎氯铵的质量浓度分别为12.50，20.30，21.60，10.70，24.20，107.00，99.30 μg/ mL，以及硫酸新霉素质量浓度为0.70 mg/mL、地塞米松磷酸钠质量浓度为0.20 mg/mL的溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

阴性对照品溶液：按处方工艺分别制备不含羟苯甲酯、苯甲酸钠、羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴铵、苯扎氯铵的阴性样品，按供试品溶液Ⅰ方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别取2.2 项下混合标准品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。本样品中未标注抑菌剂，通过单标溶液的定位，供试品溶液色谱中羟苯乙酯同位置出峰，实际样品中含有羟苯乙酯。

图1 高效液相色谱图1.Methylparaben 2.Sodium benzoate 3.Ethylparaben 4.Propylparabe 5.Thiomersal 6.Benzalkonium bromide 7.Benzalkonium chlorideA.Mixed standard solution B.Test solution Ⅰ C.Test solution Ⅱ D.Negative control solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察、检测限与定量限确定：精密量取2.2 项下混合标准品贮备液 0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，6.0，10.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加水定容，即得系列线性标准品混标溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程。结果见表1。将各标准品溶液逐级稀释，以10 倍信噪比（S/N）对应的质量浓度为各成分的定量限，以3 倍S/N对应的质量浓度为各成分的检测限。结果见表1。

表1 线性关系考察、定量限与检测限确定结果Tab.1 Results of linear relationship test，LOQ and LOD

精密度试验：精密吸取混合标准品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件进样测定6次，记录峰面积。结果羟苯甲酯、苯甲酸钠、羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴铵、苯扎氯铵峰面积的RSD分别为0.32%，0.52%，0.45%，0.39%，0.25%，0.40%，0.38%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下混合标准品溶液，分别于0，1，2，3，6，8，12 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果羟苯甲酯、苯甲酸钠、羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴铵、苯扎氯铵含量的RSD分别为 0.25%，0.35%，0.19%，0.22%，0.37%，0.43%，0.41%（n= 7），表明混合标准品溶液在12 h 内稳定性良好。

重复性试验：分别取样品 5 支，共 6 份，按 2.2 项下方法制备供试品溶液Ⅰ，按2.1 项下色谱条件进样测定，其中含有的羟苯乙酯的RSD为1.32%（n=6）；分别取样品5支，共6份，按2.2项下方法制备供试品溶液Ⅱ，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果羟苯甲酯、苯甲酸钠、羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴铵、苯扎氯铵峰面积的RSD分别为0.95%，1.02%，0.89%，1.11%，1.15%，0.97%，1.09%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取重复性试验项下供试品溶液Ⅱ9 份，分为 3 组，分别加入混合标准品溶液 0.8，1.0，1.2 mL，按2.1 项下色谱条件进样测定，以外标法计算含量，并计算回收率和RSD。结果羟苯甲酯、苯甲酸钠、羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴铵、苯扎氯铵的加样回收率分别为97.24%，98.55%，98.67%，99.85%，97.99%，97.55%，98.72%，RSD分别为0.93%，0.87%，1.02%，0.97%，0.67%，0.88%，0.85%（n=9）。

耐用性试验：取2.2项下单标溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，分别考察3 个批次月旭Ultimate®XB - C18柱，按磷酸水的pH ± 0.5，梯度每个时间点±1 min，柱温 ± 2 ℃，流速 ± 0.1 mL/min 进行调整，分离度均能大于1.5，符合定量测定相关要求。

2.4 样品含量测定

取 6 批（批号分别为 20050203，20050204，20060102，20060103，20060104，20060105）样品，依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定6 次，记录峰面积，并计算含量。结果羟苯乙酯的含量分别为325.29，330.86，336.61，341.25，334.57，335.26 μg/mL，其余抑菌剂未检出。

3 讨论

3.1 色谱条件选择

曾考察不同有机相（甲醇［2］、乙腈［3］、甲醇 - 乙腈混合溶液）；曾考察不同水相［1%三乙胺（磷酸调pH 为3.5）［4］、20 mmol 磷酸二氢钾和20 mmol 磷酸氢二钾（磷酸调 pH 为3.0）、20 mmol 磷酸二氢钠［5］、1%冰醋酸［6］、磷酸水溶液（磷酸调pH 为3.5）［7-8］］；色谱柱曾考察不同键合相C8柱、C18柱，以及不同键合工艺具有不同选择性的C18柱［9-10］；曾考察不同梯度洗脱条件［11］及不同比例等度洗脱条件［12-15］。最终，选择月旭Ultimate®XB - C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），甲醇（A）- 磷酸水溶液（磷酸调pH为3.5，B）进行梯度洗脱。