Hedgehog通路关键基因在脑胶质瘤中表达模式的相关研究

王仕超，任晓敏，潘园园，李霞

(呼和浩特市第一医院临床医学实验室，呼和浩特 010010)

Hedgehog(Hh)信号通路在胚胎发育过程中高度保守并起到枢纽作用，负责调节组织分化、维持组织稳态以及干细胞的干性等[1-2]。Hh信号通路的失调与多种肿瘤发生密切相关，如基底细胞癌、脑胶质瘤、肺癌及消化道肿瘤等[3-4]。常春藤胶质细胞瘤图谱项目(Ivy Glioblastoma Atlas Project，Ivy-GAP)[5]是一个建立在解剖学基础上的人类胶质母细胞瘤的转录图谱，其通过极为严格的组织病理学筛选收纳了41例胶质母细胞瘤患者的病理组织，从每个肿瘤的不同病理区域分离出122个样本，利用激光显微切割系统对肿瘤组织由内而外进行如下病理分区：肿瘤细胞区(cellular tumor，CT)、周围细胞坏死区(pseudo-palisading cells around necrosis，CT-PAN)、增生性血管区(hyperplastic blood vessels in cellular tumor，CT-HBV)、肿瘤浸润区(infiltrating tumor，IT)、前缘(the leading edge，LE)，并在相应区域分离RNA获得各区间基因的信使RNA(messenger RNA，mRNA)表达量用以后续分析。此数据库创建了更为全面的胶质母细胞瘤细胞发生变异的可疑分子集合，能够更加深入地研究肿瘤异质性。本研究数据主要来源于Ivy GAP-艾伦脑科学研究所数据库平台提供的较为客观的病理组织测序等结果，并利用此平台对Hh信号通路的8个关键基因 CDO兄弟同源物(brother of CDO，BOC)、SMO(Smoothened)、CDON(cell adhesion associated，oncogene regulated)、PTCH1(Patched 1)、GAS1(growth arrest specific 1)、HHIP(Hedgehog inte-racting protein)、脑胶质瘤相关癌基因同源物(glioma-associated oncogene homolog，GLI)、SHH(Sonic Hedgehog)在不同的脑胶质瘤病理分区、分子亚型、甲基化与否等条件下呈现的表达模式进行分析，以评估这些基因在脑胶质瘤发生发展过程中的潜在作用。

1 材料与方法

1.1数据支持 征募患者的临床和基因组数据可在Ivy GAP临床和基因组数据库(ivygap.swedish.org/home)中获得。在Ivy GAP数据库下载页面(http://glioblastoma.alleninstitute.org/static/download.html)主要显示两部分内容，第一部分为肿瘤、解剖结构(肿瘤特征)及研究样本的概要信息，包括患者及肿瘤信息、每个肿瘤亚块的图像及解剖结构、每个肿瘤亚块各解剖结构的基因表达列表、研究样本的RNA-Seq数据；第二部分为RNA测序数据，包括所有样本的归一化基因水平FPKM值(如RNA-Seq页面)(zip)，每个样本的非标准化基因级FPKM和TPM值的文件URL (csv)，用于处理RNA-Seq数据的参考基因组(zip)等一系列相关文件。

1.2数据方案 基于上述平台提供的数据支持，本研究主要针对Hh信号通路的关键基因在脑胶质瘤的不同病理分区、分子亚型[6]、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)基因突变及O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyl-transferase，MGMT)基因甲基化状态4个层面进行深入分析，主要分析依据为基因的mRNA表达水平。

①分析Hh信号通路的8个关键基因(BOC、SMO、CDON、PTCH1、Gas1、HHIP、GLI、SHH)在脑胶质瘤的5个病理分区(CT、CT-PAN、CT-HBV、LE、IT)的表达模式。LE部分肿瘤细胞与正常细胞的比值为(1～3)∶100。IT是位于LE和CT之间的中间条带，通常以星状突起为标志。CT作为肿瘤组织的核心区域，其肿瘤细胞与正常细胞的比例为100∶1～500∶1。CT-PAN是由假胞质样细胞形成的一段狭窄坏死边界，CT-HBV是一种在肿瘤中随处可见的内壁增厚的血管增殖区域。②分析上述基因在经典型、神经元型、间质型、前神经元型4个分子亚型间的表达模式。③对选取的样本根据IDH基因是否变异、是否进行MGMT基因甲基化进行分组，结合上述基因的mRNA水平进行收集和整理数据。

1.3统计学方法 利用R编程语言对Hh信号通路的关键基因在脑胶质瘤组织结构、临床参数、基因组数据等方面的基因表达值绘制箱形图和热图，并进行统计分析。采用Mann-Whitney检验评估样本组间的差异，采用Kruskal-Wallis检验和Dunn′s多重检验进行多重比较计算中位数，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Hh信号通路的8个关键基因表达与脑胶质瘤不同病理分区的关系 BOC、SMO、Gas1在CT的表达水平最高，在LE的表达水平最低，且BOC与SMO在几个病理分区间的表达模式类似，随着肿瘤组织核心区由内而外的扩展表达水平呈下降趋势。CDON在CT-PAN的表达水平最高，与其他4个病理分区比较差异均有统计学意义(均P<0.001)。PTCH1在CT的表达水平与CT-HBV及CT-PAN比较差异有统计学意义(P<0.05)，与LE、IT比较差异无统计学意义(P>0.05)。HHIP的表达水平由肿瘤向临界组织延伸而随之增高，在 LE表达水平最高，而SHH、GLI在5个病理分区间的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，表达水平接近为零。见图1。

2.2Hh信号通路的8个关键基因表达与脑胶质瘤不同分子亚型的关系 BOC与SMO在间质型脑胶质瘤组织内的表达水平高于其他亚型(P<0.05)，在前神经元型脑胶质瘤组织内表达水平最低。CDON和PTCH1的表达模式与BOC和SMO相反，在前神经元型脑胶质瘤组织中表达水平最高；GAS1在经典型脑胶质瘤组织内的表达水平高于前神经元型脑胶质瘤(P<0.01)。HHIP、SHH、GLI在4个分子亚型中的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注：BOC为CDO兄弟同源物，SMO为Smoothened，CDON为cell adhesion associated，oncogene regulated，PTCH1为Patched 1，GAS1为growth arrest specific 1，HHIP为Hedgehog interacting protein，GLI为脑胶质瘤相关癌基因同源物，SHH为Sonic Hedgehog，CT为肿瘤细胞区，CT-HBV为增生性血管区，CT-PAN为周围细胞坏死区，IT为肿瘤浸润区，LE为前缘；*为P<0.05，**为P<0.01，***为P<0.001

注：BOC为CDO兄弟同源物，SMO为Smoothened，CDON为cell adhesion associated，oncogene regulated，PTCH1为Patched 1，GAS1为growth arrest specific 1，HHIP为Hedgehog interacting protein，GLI为脑胶质瘤相关癌基因同源物，SHH为Sonic Hedgehog；*为P<0.05，**为P<0.01，***为P<0.001

2.3Hh信号通路的8个关键基因表达与脑胶质瘤IDH基因突变的关系 IDH基因突变组CDON与PTCH1的表达水平显著高于IDH基因野生型组(P<0.05)，SHH、SMO、GLI、BOC、HHIP的表达水平低于IDH基因野生型组(P<0.05)，两组间GAS1的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.4Hh信号通路的8个关键基因表达与脑胶质瘤MGMT基因甲基化的关系 MGMT基因甲基化组的GAS1、BOC、SHH表达水平高于MGMT基因非甲基化组(P<0.05)；PTCH1、HHIP、GLI表达水平低于MGMT基因非甲基化组(P<0.05)；两组间SMO、CDON的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

注：IDH为异柠檬酸脱氢酶，SHH为Sonic Hedgehog，SMO为Smoothened，CDON为cell adhesion associated，oncogene regulated，GLI为脑胶质瘤相关癌基因同源物，GAS1为growth arrest specific 1，BOC为CDO兄弟同源物，PTCH1为Patched 1，HHIP为Hedgehog interacting protein

注：MGMT为O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶，SHH为Sonic Hedgehog，SMO为Smoothened，CDON为cell adhesion associated，oncogene regulated，GLI为脑胶质瘤相关癌基因同源物，GAS1为growth arrest specific 1，BOC为CDO兄弟同源物，PTCH1为Patched 1，HHIP为Hedgehog interacting protein

3 讨 论

既往研究发现，Hh信号通路的异常激活与多种肿瘤的发生密切相关[6-8]，而Hh信号通路调控脑胶质瘤的发生机制尚未明确。本研究通过对Ivy GAP-艾伦脑科学研究所综合数据库的分析，阐述了Hh通路中关键基因表达的瘤间和瘤内异质性[7]以及这些基因表达的潜在预后意义。

按照该数据库对脑胶质瘤组织的病理划分标准，肿瘤核心区较其他病理分区肿瘤细胞分布最为密集，因此肿瘤核心区的基因表达差异在肿瘤分子层面也最具有代表性。SMO作为Hh通路的效应蛋白被证实其表达增高与多种肿瘤的恶性增殖相关[8]。本研究中，BOC、SMO、Gas1在CT的表达水平最高，在LE的表达水平最低；且BOC与SMO在几个病理分区间的表达模式高度相似，即随着肿瘤组织核心区由内而外的扩展表达水平呈下降趋势，提示BOC作为SMO上游的跨膜蛋白可能调控SMO的表达。CDON在CT-PAN的表达水平最高，与其他4个病理分区比较差异均有统计学意义(P<0.001)，可能与胚胎期神经管发育过程中CDON具有促凋亡作用[9]有关；同时，CDON也被描述为一种依赖性受体，在SHH缺失的情况下触发细胞凋亡，这种CDON促凋亡活性被认为可以抑制肿瘤进展。

PTCH1基因作为肿瘤抑制因子发挥作用，其基因突变与基底细胞痣综合征、食管鳞状细胞癌、毛母细胞瘤、膀胱移行细胞癌以及无脑畸形有关[10]。本研究结果显示，PTCH1在CT的表达水平与CT-HBV及CT-PAN比较差异有统计学意义(P<0.05)，与LE、IT比较差异无统计学意义(P>0.05)。推测可能与PTCH1通过选择性剪接可编码不同亚型的多个转录本有关。有研究在胃癌与胃上皮肉瘤中进行HHIP mRNA定量检测发现，在胃癌组织内HHIP的表达水平明显下降[11-12]。本研究中HHIP在不同病理分区的表达模式与其他基因相反，其表达水平由肿瘤核心向临界组织延伸而随之增高，在LE表达水平最高，与上述研究结果一致。且本研究结果显示，SHH、GLI在5个病理分区间的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，但目前已有研究证实Hh信号通路的两个主要基因(SHH、GLI)与脑胶质瘤的恶性增殖显著相关[13-14]，且迄今尚未发现关于在脑胶质瘤不同病理学分区中对SHH、GLI表达进行分析的报道，推测原因可能为该数据库利用二代测序技术对靶向基因进行测序，而针对SHH、GLI基因进行检测的探针设计存在偏差，但此结论还有待进一步证实。

本研究中，BOC与SMO在间质型脑胶质瘤组织内的表达水平高于其他亚型(P<0.05)，与学者利用TCGA数据库进行分析的研究结果[15-16]一致。间质型胶质母细胞瘤中NF1等致癌基因过表达，诱导蛋白激酶B信号通路异常激活、肿瘤坏死因子超家族及核因子κB信号通路高表达，导致此类型脑胶质瘤的坏死率较高和肿瘤侵袭性较强，预后极差[17]。上述结果提示，BOC与SMO可能在间质型脑胶质瘤细胞内存在某些调控关系，两者均可激活Hh通路，进一步诱导肿瘤细胞恶性增殖和侵袭。本研究结果显示，PTCH1、CDON在前神经元亚型脑胶质瘤组织中表达水平最高，提示这两个基因在脑胶质瘤的发病过程中可能起到类似抑癌基因的作用；HHIP、SHH、GLI在4个分子亚型中的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，分析其原因为这4种亚型的脑胶质瘤并非独立存在，同一患者脑胶质瘤内不同微环境中可能分布着不同亚型表现的脑胶质瘤起始细胞或脑胶质瘤干细胞，因此肿瘤异质性可能会影响某些基因的表达模式[18]。

IDH1/2基因参与细胞代谢，其发生突变后影响肿瘤的发生发展。脑胶质瘤患者若存在IDH1或IDH2基因突变，则肿瘤内部血管的分布密度降低，肿瘤细胞的增殖速度减慢，侵袭程度降低，患者预后较好[19-20]，因此明确IDH1/2基因突变与否能够特异性指导靶向治疗。本研究结果显示，IDH基因突变组CDON与PTCH1的表达水平显著高于IDH基因野生型组(P<0.05)，提示CDON及PTCH1的表达可能受IDH基因突变体高甲基化调控，在肿瘤的发生发展中可能发挥抑癌基因的功能。IDH1/2基因未突变型肿瘤主要通过升高缺氧诱导因子-1表达水平，促使线粒体对氧消耗的需求增加并降低活性氧聚集等途径来改变肿瘤细胞的代谢途径。本研究中，IDH基因突变组SHH、SMO、GLI、BOC、HHIP的表达水平低于IDH基因野生型组(P<0.05)，原因可能为上述基因通过Hh信号转导通路参与了细胞能量代谢过程，影响脑胶质瘤的预后。

MGMT基因表达增高能对抗烷化剂药物杀伤肿瘤细胞的作用，启动耐药机制[21-22]。其启动子区CpG岛的过度甲基化会降低基因的表达，此类型脑胶质瘤患者生存期延长。本研究结果显示，MGMT基因甲基化组的GAS1、BOC、SHH表达水平高于MGMT基因非甲基化组(P<0.05)；PTCH1、HHIP、GLI表达水平低于MGMT基因非甲基化组(P<0.05)；两组间SMO、CDON的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示上述基因可能独立于MGMT基因甲基化通过Hh信号通路调控肿瘤的发生。

综上所述，Hh通路上BOC、SMO、CDON等关键基因在脑胶质瘤组织中呈现不同程度的表达差异，参与调控脑胶质瘤的不同发展过程。近年来，脑胶质瘤的分子生物学分型及肿瘤异质性被越来越多的研究者关注，但肿瘤异质性与治疗耐药性导致脑胶质瘤对单一靶点治疗的反应有限。本研究初步阐述了Hh通路多个关键基因与脑胶质瘤发生发展及预后的潜在关系，可为后期多靶点、多机制联合治疗脑胶质瘤提供理论基础。