人巨细胞病毒感染机体细胞免疫学机制的研究进展

韦爱萍，宋雅琴，彭薇，谢政军

(1.遵义医科大学第五附属(珠海)医院血液内科，广东 珠海 519100； 2.遵义医科大学珠海校区，广东 珠海 519000)

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)即人疱疹病毒5型，是β疱疹病毒家族的一员。虽然HCMV在人群中的感染率较高，但在健康人群中多表现为潜伏感染，当机体免疫力下降时才会发生再激活引起病毒载量增加，从而播散演变成巨细胞病毒病。其受累人群主要是新生儿、老年人、器官移植及免疫缺陷者。HCMV感染机体往往较隐匿，在早期机体抗HCMV免疫反应过程中自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)占优势，之后机体接触来自HCMV抗原的持续性刺激导致T细胞活化[1]，随后产生HCMV特异性T细胞[2]。HCMV在机体内多以低病毒载量潜伏状态存在，但在炎症等诱因作用下，短期内病毒载量增加，在NK细胞、HCMV特异性T细胞等免疫细胞作用下又会恢复至低病毒载量的潜伏状态。在这种不定时、间歇性的病毒抗原长期刺激下，HCMV特异性T细胞增殖扩张，从而导致T细胞亚群失衡，最终影响T细胞功能甚至出现T细胞衰竭[3-4]。机体感染HCMV后通过一系列复杂的免疫反应限制和清除HCMV。反之，HCMV通过编码大量干扰主要效应机制的基因产物来逃避机体免疫攻击[5]。机体对HCMV的免疫反应包括体液免疫和细胞免疫，细胞免疫的机制更为复杂。现就HCMV感染机体细胞免疫学机制的研究进展予以综述。

1 NK细胞对HCMV感染的细胞免疫的应答过程

1.1NK细胞在HCMV感染过程中的作用及免疫过程 在固有免疫系统中，NK细胞充当第一道防线。HCMV感染后NK细胞被激活，并在病毒感染早期、T细胞反应产生前以及建立适应性免疫反应后发挥重要作用。NK细胞表面表达多种激活性和抑制性受体，受体均由生殖细胞编码，通过整合其表面受体所接收的信号启动机体免疫反应，从而为机体提供病毒感染的防御反应。NK细胞表达人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)Ⅰ类分子的抑制性受体，HCMV通过降低靶细胞的HLAⅠ类分子的表达水平从而逃避T细胞的识别，而HLAⅠ类分子低表达则导致活化信号产生，激活NK细胞，识别和消除病毒感染的靶细胞。NK细胞与树突状细胞相互作用并产生一系列细胞因子和趋化因子(如γ干扰素、肿瘤坏死因子-α、巨噬细胞炎性蛋白-1α、巨噬细胞炎性蛋白-1β和正常T细胞表达和分泌的活性调节蛋白)直接参与免疫防御，这些细胞因子和趋化因子可以招募和调节适应性免疫反应，增强靶细胞的HLAⅠ类分子表达[6]。

NK细胞活化包括以下步骤。①接触：HCMV颗粒或被HCMV感染的靶细胞与NK细胞表面受体结合，触发下游的转导信号。②黏附：被认为是NK细胞效应功能的先决条件，并在NK细胞和靶细胞之间形成“免疫突触”，为释放细胞毒性颗粒提供一个封闭的微环境。当NK细胞与靶细胞之间的信号传递表现为抑制性信号，则NK细胞不被活化；相反，则形成稳定的激活突触，NK细胞发生活化。③极化：NK细胞与靶细胞发生黏附后，NK细胞分泌性溶酶体(也称为细胞毒性颗粒)即刻出现极化。磷脂酰肌醇-3-激酶在NK细胞细胞毒性中起关键作用，是第二信使形成的关键，颗粒极化由磷脂酰肌醇-3-激酶→鸟苷酸转换因子→Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1→p21激活激酶→促分裂原活化的蛋白激酶激酶→胞外信号调节激酶途径所触发[7]。④脱颗粒：依赖于线粒体凋亡抑制因子vMIA-m38.5的表达，vMIA-m38.5是HCMV基因UL37.1编码HCMV vMIA-UL37.1的同源基因。

1.2HCMV感染状态下影响NK细胞功能的受体及相关分子通路变化 NK细胞通过其表面激活性和抑制性受体之间传递的信号来调节其功能，HLAⅠ类分子是NK细胞受体识别的主要分子家族，NK细胞功能的发挥取决于NK细胞抑制性受体与靶细胞表面HLAⅠ类分子的选择性结合[8]。HLAⅠ类分子通常与抑制性受体[如Ly49A和CD94/NK细胞凝集素样受体亚家族C成员1(NK cell lectin-like receptor subfamily C member 1，NKG2A)]结合而抑制NK细胞的功能，抑制性受体通过位于受体胞质结构域的一个或多个免疫受体酪氨酸抑制基序介导其作用。NK细胞表面受体与配体结合后，免疫受体酪氨酸抑制基序激活胞内含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶1，导致含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶1磷酸化和募集，从而使下游的刺激信号去磷酸化，为NK细胞提供阻断激活信号的物理环境。

NK细胞利用其表面受体来识别靶细胞，这些NK细胞表面的受体需要靶细胞表面的HLAⅠ类分子的协助才能发挥作用，又称为HLAⅠ类分子依赖性受体。HLAⅠ类分子依赖性受体有3个不同的家族：C型凝集素样受体(如CD94/NKG2A或CD94/NKG2C)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(leukocyte associated immunoglobulin-like receptor-1，LIR-1)和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immnoglobulin-like receptor,KIR)[9]。CD94/NKG2受体可以激活激活性受体(如CD94/NKG2C)或抑制性受体(如CD94/NKG2A)，但只识别HLA-E。LIR-1可识别所有的HLAⅠ类分子，并具有不同的特异性。而激活性和抑制性KIR则识别所有经典的HLAⅠ类分子(HLA-A、HLA-B和HLA-C)，但具有等位基因特异性，在某些情况下以肽选择的方式识别[10]。这些受体监测HLAⅠ类分子表达的变化，以诱导靶细胞溶解。NK细胞激活性受体与配体结合发挥效应功能，激活NK细胞受体的配体，包括HLAⅠ类分子结合肽、受体诱导的自配体、外源的病毒编码分子以及免疫复合物(免疫球蛋白Fc段与CD16结合)[11]。

原发性HCMV感染产生强烈的NK细胞反应与激活性受体NKG2C的过表达有关[12]。HCMV感染会触发NKG2C+NK细胞的扩增，这些细胞同时高表达LIR-1和KIR[13]。NKG2C是C型凝集素样受体家族成员之一，其与CD94形成异二聚体，能够与HLA-E分子相互作用。NKG2C表达的NK细胞选择性扩增依赖于某些细胞因子的存在以及NKG2C和HLA-E与特定肽的相互作用[14]。另外，HCMV提供UL40衍生的肽，其在感染的靶细胞中维持HLA-E的表达，从而通过NKG2A抑制NK细胞活化。以NKG2C为特征的特定NK细胞群中，NKG2CbrightNK细胞被认为是一群HCMV特异性记忆性NK细胞，能够识别特定的病毒蛋白，且NKG2Cbright细胞是一种长寿命的细胞，在初次感染后数量不断增加，抗HCMV水平与NKG2C的扩增有直接关系[12]。HCMV能维持NKG2A的配体HLA-E表达，提供一种抑制肽负载的模拟肽[15]。HCMV感染的靶细胞的HLA-E也能被激活性受体CD94/NKG2C所识别，但抑制性受体CD94/NKG2A与HLA-E结合的亲和力高，即抑制性受体的负性信号占主导地位，作用结果则倾向于抑制靶细胞HLA-E表达，故NKG2A与NKG2C协同作用可抑制NK细胞反应[16]。

LIR-1是一种抑制性受体，可与经典(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和非经典(HLA-G)等HLAⅠ类分子结合。LIR-1可作为病毒复制的生物标志物，反映HCMV病毒载量变化。LIR-1与HCMV UL18结合的亲和力远高于其天然配体HLA-G，表达UL18的HCMV感染细胞能抑制LIR-1+NK细胞，UL18可以增强NK细胞的杀伤力。因此，在HCMV间歇性再激活过程中，UL18上调可诱导LIR-1表达[17]。HCMV感染能增加NK细胞LIR-1的表达，HCMV抗体水平与NK细胞中LIR-1表达呈负相关，HCMV抗体在高表达LIR-1+NK细胞的机体中表达水平降低[18]。

KIR属于免疫球蛋白样超家族成员，具有以下特点：①KIR是包含抑制性和激活性受体的配对受体家族；②HCMV感染后抑制性KIR配体的表达被下调；③KIR是高度多态的，许多多态性位于HLAⅠ类分子结合位点外；④许多活化的KIR不与宿主配体结合[19]。NK细胞通过其膜上的KIR识别HLAⅠ类分子，引起胞质免疫受体酪氨酸抑制基序发生磷酸化，募集Src同源区2蛋白酪氨酸磷酸酶1，产生抑制性或激活性信号，从而调节NK细胞和部分T细胞的免疫应答[20]。NK细胞通过KIR等受体的表达，区分健康的“自我”和多种被HCMV感染的靶细胞，进而发挥免疫功能[21]。在NK细胞中有两种类型的KIR分子(激活分子和抑制分子)，长胞质尾的KIR(KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3)具有抑制淋巴细胞效应功能，而短胞质尾的KIR(KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1)通过相关的DNA X激活蛋白12分子激活淋巴细胞，KIR-L由于带有免疫受体酪氨酸抑制基序的细胞质尾具有受体抑制作用，而KIR-S受体具有短细胞质尾且有跨膜正电荷，从而与带有免疫受体酪氨酸激活基序的适配器分子(如DNA X激活蛋白12)关联[22]。一般情况下，KIR2D受体结合HLA-C配体，KIR3D受体结合HLA-A和HLA-B配体。当靶细胞表面表达HLAⅠ类分子，通过NK细胞上KIR抑制性受体与HLAⅠ类分子结合并释放抑制信号，阻断NK细胞的杀伤活性，保护靶细胞不被NK细胞消灭，而激活的KIR-S数量对HCMV感染有潜在保护效应，对HCMV的保护程度也随着KIR-S激活数目的增多而增加[23]。

2 T细胞对HCMV感染的细胞反应的应答过程

2.1HCMV感染后机体T细胞反应的特点及辅助参与细胞 一定数量的HCMV抗原暴露后，单核巨噬细胞、树突状细胞及B细胞等抗原呈递细胞参与启动机体适应性免疫反应，促使T细胞识别特定的病毒抗原(磷酸化蛋白65、包膜糖蛋白B等)，随后产生HCMV抗原特异性T细胞。T细胞受体通过识别其靶表位产生HCMV表位特异性T细胞，该亚群细胞为单克隆性，从而决定HCMV抗原表位特异性T细胞抗病毒的精确性。HCMV表位特异性T细胞的产生来自幼稚的T细胞受体记忆库，该记忆库具有多样性，可以针对不同的抗原表位刺激提供有效的免疫反应，并维持免疫效应所需的免疫表型。记忆性T细胞再次接受抗原表位刺激后，表位特异性T细胞增殖分化，从而以定量和定性的方式影响随后的T细胞亚群。T细胞受体的多样性反映了针对 HCMV抗原表位有效免疫力的强弱。理论上T细胞受体具有多样性，但胸腺选择限制了这一多样性，使相应的抗原特异性前体数量也受到限制，经过一系列细胞免疫过程最终形成针对不同表位的单克隆特异性T细胞。针对HCMV抗原表位特异性T细胞免疫形成过程见图1。

有数据表明，在首次检测到HCMV-DNA后，机体对HCMV的早期T细胞反应平均在第7天达到峰值，T细胞反应最初以CD4+T细胞为主，具有辅助性T细胞1细胞因子特征，CD4+T细胞分泌γ干扰素和肿瘤坏死因子-α等细胞因子，CD4+T细胞反应数天后，HCMV患者外周血中可检出具有HCMV特异性的CD8+T细胞[24]。HCMV特异性CD4+和CD8+T淋巴细胞分别识别HLAⅡ类分子和HLAⅠ类分子所表达的病毒肽，CD8+T细胞能产生高水平效应分子[如白细胞介素(interleukin，IL)-2、γ干扰素、肿瘤坏死因子-α、穿孔素和颗粒酶]，CD4+T细胞分泌大量的细胞因子辅助CD8+T细胞对HCMV产生反应[25]。

2.2HCMV感染后CD4+T细胞应答的主要分子变化 CD4+T细胞是HCMV感染的适应性免疫反应的重要效应因子，在机体初次感染后，HCMV特异性CD4+T细胞群持续存在于机体的T细胞库中，以控制病毒在宿主生命周期内的再激活。CD4+T细胞在抗病毒免疫应答中的作用大致可分为3类：淋巴细胞向感染部位募集；介导其他效应细胞的扩张；通过细胞因子的产生或细胞介导的细胞毒性发挥抗病毒作用。T细胞表达CD28和CD40配体等共刺激分子，这些共刺激分子聚集是引起CD4+T细胞胞内信号传递和随后激活所必需[26]。

HCMV特异性CD4+T细胞的表型在感染的不同阶段具有不同的表型特征，在HCMV感染高峰期，HCMV特异性CD4+T细胞表型为CD45RA/CD45RO双阳性细胞，表达CD27、CD28、CD38和CD40配体。而潜伏期，HCMV特异性CD4+T细胞表型为CD27/CD28双阴性细胞。HCMV特异性CD4+T细胞在感染高峰期和潜伏期均能产生经典的辅助性T细胞1细胞因子(如IL-2、γ干扰素和肿瘤坏死因子-α)。Roquin是一种细胞因子，在稳定状态下控制各种抗病毒基因的表达，以调节免疫稳态，其功能在感染早期和晚期保持不变。Roquin是HCMV诱导免疫调节的关键调节因子，在HCMV感染过程中被诱导表达，HCMV积极利用Roquin进行高效的病毒合成。干扰素调节因子1是一种转录因子，主要通过诱导促炎细胞因子和促进抗病毒免疫反应来调节免疫应答，而Roquin抑制干扰素调节因子1的表达则可促进HCMV的高效复制[27]。如能寻找到抑制这两个分子的靶点可能抑制HCMV复制，从而达到治疗目的。HCMV可编码免疫抑制IL-10同源基因，IL-10是辅助性T细胞1细胞因子的一种强有力的抑制剂，也能抑制单核细胞产生炎症细胞因子，从而导致表面HLAⅡ类分子表达减少，并降低CD4+T细胞抗原的表达。IL-10能明显抑制MCMV感染慢性期T细胞的增殖[28]。

注：TCR为T细胞受体，HCMV为人巨细胞病毒，pp为磷酸化蛋白，IE1为立刻早期蛋白1，gB为包膜糖蛋白B

2.3HCMV感染后CD8+T细胞应答的主要分子变化 HCMV已被证明可诱导抗原特异性CD8+T细胞克隆扩增，HCMV感染能诱导宿主产生大量效应记忆CD8+T细胞[29]。CD8+T细胞能限制HCMV复制，但不能消除或抑制其传播。HCMV多轮抗原刺激导致机体HCMV特异性CD8+T细胞的克隆性扩增，随着年龄的增长HCMV特异性CD8+T细胞不断累积，增加的CD8+T细胞数量能有效控制HCMV潜伏感染再激活。因此，在活跃的免疫反应中，CD8+T细胞快速克隆扩增可作为免疫介导疾病持续感染的标志。T细胞受体识别细胞表面HLAⅠ类分子所表达的同源抗原肽，介导HCMV表位特异性CD8+T细胞的产生。HCMV特异性CD8+T细胞通过释放γ干扰素和颗粒酶(中性粒细胞、生长因子受体结合蛋白、G蛋白偶联受体激酶、代谢型谷氨酸受体)来控制HCMV感染，这些细胞因子水平在受刺激后数小时内升高[30]。HCMV特异性CD8+T细胞可产生趋化因子，将免疫细胞(如CC趋化因子配体4、CC趋化因子配体5)吸引到感染部位，上述免疫细胞可趋化NK细胞、单核细胞以及活化的T细胞。因此，HCMV特异性CD8+T细胞是具有强大效应功能的多功能细胞，能诱导和维持免疫反应。已有多项临床试验证实HCMV特异性T细胞的过继细胞免疫治疗具有抗HCMV作用(表1)，HCMV特异性T细胞过继细胞免疫治疗在造血干细胞移植后100 d内防治巨细胞病毒病方面具有良好的应用前景；HCMV特异性T细胞在实体器官移植受者中被证明具有保护作用[37]；HCMV特异性T细胞治疗巨细胞病毒病有一定的疗效，如HCMV视网膜炎[38]；HCMV特异性T细胞在预防先天性 HCMV感染中也起到一定作用[39]。但HCMV特异性T细胞过继细胞免疫治疗存在持续时间短、效应功能发挥有限等局限性，仍需进一步研究。

2.4HCMV感染后CD4/CD8相互关系 HCMV特异性免疫应答与CD4/CD8密切相关，HCMV感染研究中CD4/CD8发生倒置，CD8+T细胞扩张性增多[40]。CD4+T细胞作为辅助细胞，在抗病毒反应中通过CC趋化因子配体3和CC趋化因子配体4促进CD8+T细胞与树突状细胞结合，从而促进CD8+T细胞进入感染部位。CD4+T细胞还能促进幼稚的CD8+T细胞进入引流淋巴结，并通过产生γ干扰素和分泌局部趋化因子，将固有性或抗原特异性的效应物导入病毒复制部位[41]。HCMV特异性CD4+T细胞的存在是维持HCMV特异性CD8+T细胞所必需。CD4+T细胞通过多种机制促进记忆性CD8+T细胞的发育，如下调肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的表达，产生IL-2等细胞因子[26,42]。但目前这两种T细胞亚群的失衡及其在抗HCMV过程中的关键分子事件尚不清楚。

3 HCMV免疫逃逸及免疫衰老

3.1HCMV免疫逃逸特点及主要分子事件 HCMV是一种对病原免疫逃逸的范式，针对复制的不同步骤而产生抗病毒作用。首先，HCMV编码细胞因子模拟物和诱饵受体，以调节细胞因子活性，限制细胞迁移和分化。其次，HCMV通过阻断转录因子的激活来抑制细胞因子的产生。第三，HCMV微RNA直接抑制机体信使RNA的转录，抑制趋化因子和细胞因子表达。

表1 HCMV特异性T细胞过继细胞免疫治疗HCMV血症和巨细胞病毒病的临床试验

HCMV基因组在感染过程中编码多种逃逸蛋白，使病毒能够调节固有性和适应性免疫反应，最终即使在免疫能力强的宿主中病毒血症也会持续存在，病毒排泄可长达数月(健康成人)甚至数年[27]。HCMV有多种方法来避免适应性免疫反应，其中一种方法是通过HCMV特异性表位抗原pp71下调靶细胞HLAⅠ类分子的表达，促进HCMV增殖复制。pp71是由UL82基因编码的磷酸化蛋白，其表观分子量为71 000。HCMV pp71蛋白被包装在病毒的被膜内，阻止转录抑制性异染色质在病毒基因组上的组装，促进病毒基因的转录翻译，通过抑制固有性和适应性免疫反应的成分来帮助免疫逃逸[43]。

3.2HCMV致免疫衰老的免疫细胞改变 与其他慢性病毒感染相比，HCMV感染可引起一种不典型的CD8+T细胞过度增殖，称为记忆膨胀，而导致CD8+T细胞膨胀的主要原因之一是重复或持续的抗原暴露刺激。在HCMV感染过程中，T细胞识别病毒表位并经历增殖性扩张，主要以HCMV特异性CD8+T细胞数量增多为主，这种现象在老年人中更为突出，大部分HCMV特异性CD8+T细胞为CD45RA+效应记忆细胞。CD45RA+效应记忆细胞群随着年龄的增长而逐渐扩大，在老年人群中占比达总效应记忆CD8+T细胞群的一半以上[28]。持续抗原刺激，如潜伏或持续的HCMV感染，被认为是CD45RA+效应记忆T细胞扩展的主要原因。T细胞受体直接识别HLAⅠ类分子呈递的病毒肽，介导HCMV特异性T细胞的产生限制和清除HCMV[19]。在受感染的细胞中，源自蛋白酶体加工病毒蛋白的抗原肽从胞质溶胶运输至内质网，加载到HLAⅠ类分子上并通过分泌途径输出至细胞表面，HCMV干扰HLAⅠ类分子抗原呈递途径的几乎所有阶段，从而避免CD8+T细胞的识别。

3.3HCMV引起免疫衰老主要分子事件 HCMV免疫反应的一个特征是效应记忆表型CD8+T细胞的积累(即CD27-CD28-/CD45RA+)，其他特征包括幼稚CD8+T细胞的频率和数量下降(即CD27+CD28+/CD45RA+)和炎症活性增强(如IL-6水平)[44]。T细胞的主要共刺激受体是CD28，然而终末分化的CD8+T细胞失去表达CD28的能力。相反，抗原驱动的T细胞活化后，其他共刺激受体(如4-1BB、OX40)在T细胞中表达，并导致小鼠巨细胞病毒特异性T细胞膨胀。老年人的HCMV特异性CD8+T细胞群的这种特殊性质与T细胞的衰老有关。

在慢性感染情况下，NK细胞和CD8+T细胞暴露于持久性抗原和(或)炎症信号，这种过多的信号常导致宿主出现慢性免疫衰竭状态[45]。免疫衰竭主要表现为效应功能(细胞因子产生和杀伤功能)的逐渐丧失、多种抑制受体(如程序性细胞死亡受体1和淋巴细胞活化基因-3)的表达、代谢失调和稳态增殖。NK细胞在HCMV感染的早期免疫反应中必不可少，随后HCMV进化出多种机制来逃避NK细胞介导的病毒清除，通过下调细胞毒性功能或引发细胞凋亡，导致NK细胞耗竭。研究显示，在慢性淋巴细胞性脉络膜脑炎病毒感染过程中，程序性细胞死亡受体1在功能耗竭的病毒特异性CD8+T细胞中表达上调，阻断程序性细胞死亡受体1通路可促进病毒特异性T细胞的效应功能，显著降低实验动物的病毒载量[30]。但程序性细胞死亡受体1在HCMV感染状态下能否促进HCMV特异性T细胞扩增发挥抗病毒效应及发生机制尚不清楚，尚待进一步阐明。

4 小 结

HCMV与宿主免疫系统之间的相互作用是一个复杂的过程，从病毒黏附进入宿主靶细胞开始，随后引起机体的细胞免疫应答，最终形成一种特异性的适应性免疫反应。NK细胞在HCMV感染早期和潜伏期对病毒的控制起重要作用，通过产生细胞因子攻击并清除HCMV感染的细胞，并在适应性免疫过程中与T细胞共同作用发挥抗病毒作用，经过一系列适应性细胞免疫反应过程产生HCMV特异性T细胞。随着感染时间的推移，HCMV通过改变T细胞亚群比例、受体与配体结合、关键信号转导通路的阻断等方式产生免疫逃逸，这种状况随年龄增长表现愈发明显甚至导致免疫衰竭。因此，在HCMV感染宿主的过程中，宿主抵御病毒的免疫机制复杂多样，病毒免疫逃逸的策略也复杂多变，仍有很多机制尚未阐明。深入了解HCMV致病的细胞免疫机制、免疫逃逸机制及其对机体免疫衰老的影响，可为HCMV感染的防控提供新思路。