孕早期外周血中lnc-C17orf64-1 ∶1对子痫前期的预测价值

陈丹,杨星宇,程蔚蔚

子痫前期是妊娠期常见而复杂的并发症，以妊娠20周后出现新发高血压和蛋白尿为主要特征，发病率约2%～8%[1]。子痫前期发病机制尚未明确，目前仍缺少有效治疗措施，及时终止妊娠是唯一的治疗方法。有研究指出，在妊娠16周之前对高危子痫前期孕妇进行早期干预有助于改善母婴结局[2]。因而早期生物标志物的探寻对子痫前期的诊断和防治改善母婴结局具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一种长度大于200个核苷酸的非编码RNA，既往被认为是“转录噪音”[3]，然而高通量测序技术的发展促进了lncRNA在各项病理生理过程中的研究，包括子痫前期的发生发展。多项研究指出，lncRNA在子痫前期患者胎盘组织或血清中异常表达，并可通过不同作用方式及信号通路，调控靶基因的表达，进而对滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学功能产生影响，参与子痫前期的发生发展[4]。本研究通过前瞻式病例对照研究，检测孕妇孕早期(11～13周)外周血中lnc-C17orf64-1∶1的表达水平，探讨其在子痫前期早期诊断中的预测价值，并分析其与收缩压和舒张压的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究为前瞻式病例对照研究，研究对象选自2018年9月至2019年9月于上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院就诊分娩的孕妇，根据妊娠结局是否发展为子痫前期分组。其中正常孕妇29例为对照组，子痫前期孕妇20例为子痫前期组。纳入标准：单胎妊娠;无慢性病史;于本院规律产检和分娩。子痫前期纳入标准严格按照美国妇产科医师学会(ACOG)指南[5]：(1)血压：孕前血压正常，妊娠20周后出现收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg，两次测量至少间隔4 h；收缩压≥160 mmHg或舒张压≥110 mmHg(重度高血压可间隔数分钟测定并诊断，以便及时进行降压治疗)。(2)蛋白尿：24 h蛋白尿≥300 mg；蛋白质/肌酐≥0.3 mg/dL；尿常规蛋白≥++(仅在其他检测方法不可用时使用)。(3)蛋白尿阴性但符合以下新发表现：① 血小板减少症：血小板计数<100×109/L；② 肾功能不全：排除其他肾脏疾病，血清肌酐浓度>1.1 mg/dL或高于正常上限2倍；③ 肝功能受损：转氨酶高于正常上限2倍；④ 肺水肿；⑤ 新发头痛，普通药物治疗无缓解，排除其他原因或视物模糊。排除标准：(1)妊娠合并内科或外科疾病(妊娠合并慢性高血压、慢性高血压并发子痫前期、糖尿病合并妊娠、妊娠期糖尿病、甲状腺功能异常、既往或妊娠合并急慢性肾炎综合征、肾病综合征等)；(2)多胎妊娠或胎儿发育畸形；(3)行人工授精或试管婴儿的孕妇；(4)孕早期无血液样本冻存或产检过程中失访的孕妇。研究经医院伦理委员会审批通过，研究对象签署知情同意书后参加。

1.2 研究方法

1.2.1 基线资料收集 收集患者年龄，体质量指数(body mass index，BMI)，诊断时收缩压与舒张压及24 h蛋白尿等临床资料。

1.2.2 外周血留取 在妊娠11～13周时收集孕妇外周血3～5 mL，冻存于-80℃冰箱留用。待分娩完成，根据妊娠结局，分为子痫前期组和对照组样本。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测孕早期孕妇外周血中lnc-C17orf64-1∶1的表达水平。

1.2.3 外周血lnc-C17orf64-1∶1检测 采用Trizol法提取外周血中总RNA，经紫外分光光度计(A260/A280)测量浓度和纯度后进行逆转录反应，生成cDNA置于-80℃的冰箱中保存。采用qRT-PCR法检测外周血lnc-C17orf64-1∶1的表达量，以18S rRNA为内参。每个样本设3个复孔，结果取其均值。采用18S rRNA标准化后ΔCT值计算外周血lnc-C17orf64-1∶1的相对表达量，ΔCT值越大，外周血lnc-C17orf64-1∶1含量越低。重复3次进行统计分析。lnc-C17orf64-1∶1正向引物：5′-ATGGTAAAGCACCCACGAAG-3′，反向引物：5′-AGATGCTGGAAGGGAGGTTT-3′；18S rRNA正向引物：5′-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3′，反向引物：5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3′。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组孕妇临床特征比较

按照纳入和排除标准，本研究共纳入49例孕妇，其中对照组29例，子痫前期组20例。两组对象年龄与BMI的比较,差异均无统计学意义(P>0.05)；与对照组相比，子痫前期组分娩孕周较小，收缩压、舒张压和24 h蛋白尿水平较高,差异有统计学意义(P<0.05),详见表1。

2.2 两组孕妇外周血中lnc-C17orf64-1∶1的表达水平

子痫前期组外周血中lnc-C17orf64-1∶1的ΔCT值小于对照组(P<0.05)，即lnc-C17orf64-1∶1在子痫前期患者外周血中呈高表达(见图1A)。

2.3 外周血中lnc-C17orf64-1∶1的表达与临床病理特征的相关性

外周血中lnc-C17orf64-1∶1的ΔCT值与收缩压及舒张压呈负相关(均P< 0.05)(见图1B)。

2.4 孕早期外周血lnc-C17orf64-1∶1含量预测子痫前期效能评价

孕早期外周血lnc-C17orf64-1∶1预测子痫前期发病的ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.9172(95%置信区间：0.8445-0.9899)，灵敏度为80.00%，特异度为86.21%，最大约登指数为0.6621，根据约登指数得出最佳截断点为13.71(ΔCT值)，阳性预测值为80.00%，阴性预测值为86.21%(见图2)。

3 讨论

子痫前期控制不良会导致孕产妇高血压、蛋白尿、肝肾功能不全、凝血功能改变等，造成胎儿宫内缺氧和生长受限，且会显著增加患者产后及后代成年后罹患心血管疾病风险[1]。目前子痫前期仍缺乏有效治疗方法，妊娠早期识别高危子痫前期并及时进行小剂量阿司匹林治疗可显著降低子痫前期发病风险，质子泵抑制剂、钙剂、他汀类药物(普伐他汀等)、微生物制剂和二甲双胍等临床干预可有效帮助改善母婴结局[1,6]。传统危险因素评估预测价值有限，因此，近年来子痫前期预测指标相关研究大量开展，主要聚焦于孕妇临床资料评估、平均动脉压(mean artery pressure，MAP)、血清学指标[如血管内皮生长因子、可溶性类酪氨酸激酶1、可溶性内皮素、胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)、妊娠相关血浆蛋白等]和孕期超声指标[子宫动脉搏动指数(uterine artery pulsatility index，UtA-PI)和子宫动脉收缩期最大血流速度与舒张期末期血流速度比值等][7]。目前认为，妊娠早期联合筛查MAP、血清PLGF、UtA-PI及孕妇高危因素评估可帮助识别子痫前期高风险孕妇[8]。

图1A 两组外周血lnc-C17orf64-1∶1ΔCT值比较

图1B 外周血lnc-C17orf64-1∶1ΔCT值与收缩压、舒张压相关性

图2 外周血lnc-C17orf64-1∶1诊断子痫前期的ROC曲线

表1 两组孕妇临床特征比较

随着高通量测序的发展，lncRNA在子痫前期中的研究逐渐兴起。通过微阵列技术和RNA测序，研究者鉴定出大量在子痫前期胎盘组织中差异表达的lncRNA，并发现它们对滋养层细胞的生物学功能具有重要作用[9]。胎盘中表达上调的lncRNA INHBA-AS1通过抑制转录因子CENPB与肿瘤坏死因子受体相关因子1(TRAF1)的启动子结合而抑制了滋养细胞的侵袭和迁移[10]；胎盘中表达下调的lncRNA HOXA11-AS可通过调节RND3和HOXA7表达影响滋养细胞的增殖和迁移[11]，lncRNA TUG1通过募集EZH2，抑制RND3的表达，进而抑制滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭，并诱导细胞凋亡[12]。

除了lncRNA在子痫前期发病机制中的研究，研究者们还探讨了其在循环血中作为子痫前期生物标志物的可能性。胎盘微阵列检测发现，某些lncRNA(NR_026824.1、AK055151.1、NR_027457、NR_024178和BC030099)在子痫前期患者胎盘组织中表达上调，而Sun等[13]通过对正常孕妇及子痫前期孕妇全血样本中上述lncRNA的检测发现，仅lncRNA BC030099在外周血中表达上调，AUC为0.713(95%置信区间：0.587-0.839)。此外，有研究检测了16周前子痫前期患者血浆中肝癌微血管侵袭相关的lncRNA MVIH的表达，分析发现其在子痫前期组血浆中表达降低，单独用于预测子痫前期时，AUC为0.763，灵敏度为65.2%，特异度为75.0%，联合尿酸、白细胞、丙氨酸氨基转移酶和尿蛋白预测可提高预测灵敏度(86.4%)和特异度(83.1%)[14]。

本课题组前期研究发现lnc-C17orf64-1∶1在子痫前期患者与正常孕妇脐静脉内皮细胞及胎盘组织中差异表达，表明其可能参与子痫前期发生发展[15]。目前我国孕妇建档时间在妊娠12周左右，而研究也指出在妊娠11～13周时对孕妇进行各项指标检测，可作为妊娠并发症风险评估的首选方法[16]。因此，本研究首次检测了lnc-C17orf64-1∶1在孕妇孕早期(妊娠11～13周)外周血中表达情况，并分析其与血压之间的相关性，探讨其作为子痫前期早期诊断生物标志物的可能性。ROC曲线分析发现，lnc-C17orf64-1∶1具有较高的灵敏度和特异度，可作为预测子痫前期生物标志物。本研究也存在一定局限性，由于纳入检测的样本量较小，且未根据子痫前期严重程度分组，后续需进一步行基础研究及多中心大样本临床验证明确lnc-C17orf64-1∶1在子痫前期发生发展中的作用及其在子痫前期发病的预测价值。综上所述，lnc-C17orf64-1∶1在子痫前期患者外周血中表达升高，且与血压严重程度相关，对子痫前期发病有一定的预测价值。