人体口腔微生物运用于法医学个体识别的研究进展

王双双，宋凤，魏晓文，顾浩宇，张珂，周玉翔，江兰睿，罗海玻

四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610044

人体是一个细胞的集合体，由大量细胞组成，除人体自身细胞，许多微生物细胞也参与人体的组成。人体内外总的细菌细胞比人自身细胞多10 倍，人体携带的大量微生物群统称为人类微生物群[1-4]。人体口腔微生物群是人类微生物的重要组成部分，是仅次于肠道的第二大复杂微生物库[5]，指定植在人体口腔的各种微生物。人体携带的微生物细胞可以脱落、沉积和转移，其过程和方式类似于人类细胞[1]，若这些细胞遗留在现场，可被法医学者侦查发现并提供可用信息，如将现场检材的微生物群落组成与犯罪嫌疑人的进行对比，可能会为案件的侦破提供线索和依据。因此，近年来微生物逐渐成为法医学者密切关注的研究对象，国外部分研究也对人体口腔微生物应用于法医学个体识别进行了有效探索[6-7]。本文就人体口腔微生物的特征及其在法医学个体识别中的应用前景进行综述，以期为法医微生物学的相关研究提供参考。

1 人体口腔微生物的特征

在人体口腔及其延续部位（止于食管末端）发现的微生物称为人类口腔微生物群，其微生物组成十分复杂，仅次于结肠[8]。人体口腔内定植了大量微生物，包括病毒、细菌、古核生物、真菌和原生动物[9]。随着美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）人体微生物项目的展开，对人体口腔微生物的研究也不断增多和加深，美国国立牙颌颅研究所（National Institute of Dental and Craniofacial Research，NIDCR）于2008 年启动了第一个人体口腔微生物组数据库（Human Oral Microbiome Database，HOMD），该数据库详细记录了口腔细菌的相关信息[4]。随后，该数据库将库内涵盖的口腔微生物栖息地进一步扩展，形成了目前扩展的人类口腔微生物数据库（expanded Human Oral Microbiome Database，eHOMD）。eHOMD 提供了在人类口腔、咽、鼻腔、鼻窦和食道等处定植的细菌种类的详细信息。在eHOMD 中，共记录了775 种微生物物种，其中57%被正式命名，13%能进行培养而未被命名，30%不能进行培养[10]。

1.1 口腔微生物的部位特异性

口腔内有很多微生物栖息地，各栖息地上定植的微生物种类存在一定程度的差异。无论是通过培养还是分子技术方法，都表明舌、牙齿、黏膜、腭和牙龈拥有各自独特的微生物群[11]。唾液含有的微生物主要属于以下几种微生物门：放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和螺旋体门（Spirochaetes）[5，12]。由于附着在口腔黏膜、牙齿等口腔结构和组织表面的微生物会不断涌入汇集到唾液中，使得唾液微生物群成为栖息在口腔表面的口腔微生物群的“指纹”[13]，这一特性使得唾液成为人体口腔微生物常用的研究样本。牙菌斑是牙齿表面的一层生物膜[14]，分为龈上牙菌斑和龈下牙菌斑[15]。牙菌斑微生物组成多样，列文虎克使用显微镜在牙菌斑中观察到多种细菌形态，这是人类对口腔微生物群落的最初认识[16]。牙菌斑微生物组成可随着疾病（如龋齿）的发生发展而产生变化，是研究口腔疾病与口腔微生物群落变化的常用研究对象。

1.2 口腔微生物的个体差异性

人类微生物组计划（Human Microbiome Project，HMP）的研究[5]表明，个体是影响微生物群落组成的主要因素，每个个体的微生物组都由特定的微生物群落组成。虽然人类之间共享着一些相似的唾液微生物，但唾液微生物组成具有个体差异性，在特定的时间范围内，特定个体的唾液微生物组成是稳定且特异的[17]。对10 名健康个体口腔内细菌多样性的研究[18]表明，个体有其独特的细菌群落，但这些细菌群落在属级分类时往往相似度高。许多环境因素可能造成这种口腔微生物的个体差异性，如吸烟、饮酒、口腔卫生等[19]，甚至地理因素也可能参与微生物个体差异性的形成。一项对来自世界12 个城市120 名个体的研究[20]在确定影响人类唾液微生物组的环境因素时发现，微生物群落的变化与经纬度存在关联。

2 微生物成为新型法医学个体识别生物标志的潜力

2.1 微生物作为新型法医学个体识别生物标志的理论基础

微生物细胞相较于人类细胞有以下优点：（1）细菌DNA 的形状为圆形，且细胞壁厚，比人类DNA 更稳定，不容易降解[6，19]。微生物细胞能够以与人类细胞类似的方式脱落、转移、沉积[1]，沉积在物品上的细菌DNA 比人类DNA 更容易持久地保存。（2）人体微生物细胞的数量远多于人类细胞。根据推测，一名健康成年人1 mL 的唾液中含有约1 亿个微生物细胞，按照750 mL/d 的正常唾液流量计算，每日从口腔流出的微生物细胞约为800 亿[21]，若唾液遗留在犯罪现场，其含有的人体口腔微生物细胞要远远多于口腔黏膜上皮细胞。当人类DNA 的量不足以得到准确分型时，对人类微生物进行分析可能会提供新的侦查方向。有研究[22]表明，人体通过与环境的接触可以改变环境中的细菌组成，包括空气中的成分，因此可从封闭环境的微生物组中刻画出人体微生物特征，甚至可以从人体与环境的交互作用中预测个人信息，如房间主人的性别[22-29]。可见通过微生物分析能为侦查提供一定的信息和线索。针对人体微生物运用于法医学个体识别领域，研究通常集中于分析微生物群落多样性[6]，比较微生物群落组成的差异性和相似性。

鉴于微生物细胞数量多和DNA 稳定性好的优点，结合微生物群落在不同个体之间、同一个体不同部位间存在差异性的特点，使得微生物有望成为法医学个体识别的生物标志。

2.2 微生物多样性研究的分子标记和检测方法

传统的微生物多样性研究方法主要通过对培养后的菌株进行形态、生物化学、免疫等方面的观察和检测从而进行鉴定，但该方法实验耗时长，且大部分微生物不能被培养，如口腔微生物中有30%不能被培养[10]，得到的微生物群落组成不够准确[30]。随着分子技术的不断发展，对于微生物研究的方法也逐步向不依赖培养分离的方向发展，由此也发现了一些分子标记可用于微生物检测分析，如16S rRNA 基因、rpoB基因、内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列等。

16S rRNA 基因是编码核糖体亚基的DNA 序列，存在于所有细菌的基因组中，具有保守性和特异性，其序列包含10 个保守区和9 个高度可变区；保守区序列能够反映物种之间的亲缘关系，而高度可变区序列在细菌物种间具有特异性，可据此对细菌进行分类和鉴定；在大多数细菌中，保守区序列相同，因此可根据保守区序列设计通用引物，进而对可变区序列进行检测分析[31]。此外，16S rRNA 基因已具有丰富详尽的参考数据库，如Greengenes 数据库（https://greengenes.secondgenome.com/）、核糖体数据库计划（Ribosomal Database Project，RDP；http://rdp.cme.msu.edu/）、SILVA核糖体RNA 数据库（https://www.arb-silva.de/），因此，16S rRNA 基因已成为细菌研究中最常用的分子标记。随着对16S rRNA 基因测序研究的不断深入，微生物群落的许多未知信息被不断揭示。

rpoB 基因是编码RNA 聚合酶β 亚基的基因，作为一种管家基因，rpoB 基因在细菌中普遍存在，并且进化速度比16S rRNA 基因快，能够对亲缘关系近的细菌进行识别和分类[32]。有研究[33-34]结果表明，rpoB基因在物种水平上比16S rRNA 基因具有更好的分辨率，适用于系统发育分析。但由于缺乏相关的序列参考数据库，在实际研究中rpoB 基因的运用相较于16S rRNA 基因少。

ITS 序列是真菌研究中优选的生物标志。ITS 序列包括进化最快的ITS 序列1、高度保守的5.8S rRNA基因和具有中等进化速度的ITS 序列2[35]。ITS 序列1和ITS 序列2 在真核微生物的主要群体之间，甚至在同一生物群体的物种内，都表现出广泛的序列多样性，这些序列多样性可用于物种鉴定和识别[36]。

许多检测方法可用于分析上述分子标记，如变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、末端限制性片段长度多态性（terminalrestriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、高分辨率熔解（high resolution melting，HRM）等。TRFLP 可以评估复杂细菌群落的多样性。在临床医学研究中，有学者[37]通过T-RFLP检测方法分析16S rRNA基因来阐明唾液过多与口腔微生物群之间的关系。在法医学研究中，NISHI 等[38]则利用T-RFLP 检测16S rRNA 基因V1～V3 可变区，对12 名志愿者手部的细菌群落组成进行了比较，研究结果表明，运用T-RFLP的检测方法分析16S rRNA 基因可变区具有区分不同个体的潜能。DGGE 是一种基于PCR 的微生物群落分析方法，能够形成微生物群落“指纹”，被广泛用于分析环境和人类微生物群落[39]。在临床研究中，DGGE可被用来分析口腔黏膜慢性炎症[40]和龋齿[41]等口腔疾病的微生物群落。但DGGE 和T-RFLP 检测方法实验耗时长，不利于快速检测，检测结果也难以进行标准化，因此在近些年的微生物多样性研究中较少使用。HRM 能够在PCR 扩增后直接对目标扩增子进行基因分型，与定量PCR 检测共平台，操作简便快捷。但HRM 曲线本身不能提供任何系统发育信息，因此，HJELMSØ 等[42]建议将HRM 作为快速识别样本中含有不同细菌群落结构的筛选工具。

随着测序技术的发展，高通量测序技术逐渐运用于微生物分子标记的检测，如扩增子测序。扩增子测序是一种高靶向性方法，分析特定基因组区域的基因变异可以反映微生物组成的差异。以16S rRNA 基因为例，可变区扩增子测序所得的序列通过相似程度（通常是97%）将其分为不同的运算分类单元（operational taxonomic unit，OTU）[43]，将每个OTU 的代表序列与微生物数据库（如Greengenes 数据库、SILVA 数据库等）里的参考序列进行比对，得到各个OTU 的物种注释，最终形成各个样本的微生物组成信息进而比较分析。对16S rRNA 基因分子标记进行扩增子靶向测序分析的方法目前在微生物多样性研究中运用十分广泛，如口腔微生物与胰腺癌的关系[44]、儿童不同发育阶段口腔微生物与口腔健康的关系[45]、区分龋齿病和健康人群[46]以及居住在不同海拔的人群口腔微生物比较[47]等。尽管扩增子测序具有测序片段短、对细菌的分辨率不能达到属级以下的缺点，但目前仍然是微生物多样性研究的主要检测手段。

3 口腔微生物运用于法医学个体识别的研究进展

3.1 口腔微生物的时间稳定性

口腔微生物作为人类第二大微生物库，具有个体差异性，在法医学个体识别中具有很大的研究前景。但在运用其进行个体识别研究之前，需要考虑口腔微生物是否随着时间发生变化。现场痕迹检材的微生物组成与犯罪嫌疑人的口腔微生物组成保持一致才能用于法医学个体识别，若个体和犯罪现场痕迹的微生物群落随着时间发生变化，则会导致匹配失败，将犯罪嫌疑人错误排除[7]。有学者[48]在研究人体唾液和牙菌斑的微生物组成和稳定性时，对细菌16S rRNA基因可变区进行检测，分析7 年间口腔细菌群落随时间的变化，结果显示没有新的细菌群落出现。因此，该研究推断，尽管唾液细菌群落存在短暂的变化，但唾液细菌的组成整体是相对稳定的。此外，不同个体的DGGE 条带图谱显示细菌群落在个体间存在很大的差异并有新的细菌群落出现[48]。该研究再一次表明人体口腔微生物具有个体差异性，并且在时间上具有相对稳定性。有研究[49]在0、1、90、91 d 4 个时间点分别采集志愿者27 个身体部位（包括口腔）的样本，分析了人体细菌群落随时间变化的稳定性，其结果表明，口腔微生物群落有明显的时空稳定性，相较于皮肤微生物和肠道微生物，个体口腔微生物的群落组成不会随着时间而发生很大的变化。以上研究结果都表明口腔微生物具有时间稳定性，为其应用于法医学个体识别提供了科学依据。

3.2 运用口腔微生物进行个体识别

LEAKE 等[6]对2 名健康志愿者的唾液微生物进行了调查研究，以探讨唾液微生物中的细菌用于区分不同个体的潜力。16S rRNA 基因的分析结果显示，可以在属水平（有时在物种水平）表征链球菌；而通过分析rpoB 基因能获得更深层次的表征，可以检测到链球菌物种和菌株水平。将16S rRNA 基因和rpoB 基因联合使用可以对不同个体进行有效区分。该研究结果显示，基于高通量测序分析唾液微生物分子标记可以用来区分不同个体的唾液样本，具有法医学个体识别的应用前景。STAHRINGER 等[50]对不同年龄段（12～13、17～18、22～24 岁）双胞胎唾液微生物多样性进行了比较。在同一年龄段的双胞胎中只观察到一种轻微的趋势：口腔微生物组成在同居的同卵双胞胎比异卵双胞胎更相似，但这种差异不具有统计学意义，说明生活在一起的双胞胎（不论同卵双胞胎还是异卵双胞胎）之间具有相似的口腔微生物组成；在17～22 岁年龄段，84%的双胞胎不再同居，双胞胎之间的相似性开始下降。该研究结果表明，环境是影响口腔微生物的主要因素，宿主的遗传因素影响甚小。此外，FREIRE 等[51]对143 对双胞胎口腔微生物多样性的研究结果也表明，宿主复杂的微生物相互作用和变化受宿主个人习惯和年龄的影响，而非遗传因素。由于同卵双胞胎拥有相同的等位基因，目前基于STR分型技术，无法对同卵双胞胎进行有效区分。口腔微生物组成受遗传因素的影响小这一特点，提示可基于口腔微生物组成鉴别同卵双胞胎。

法医学个体识别中最重要的是将现场检材与犯罪嫌疑人的分析结果进行匹配。有研究[52]招募了16名志愿者，采集其咬痕和牙齿拭子，针对链球菌16S rRNA基因可变区序列、16S-23S rRNA 基因间隔区（intergenic spacer region，ISR）序列和rpoB 基因序列进行二代测序分析，成功将咬痕的口腔链球菌序列与对应牙齿的链球菌序列相匹配。结果显示，16S rRNA 基因、ISR 序列、rpoB 基因3 种模型能够正确匹配咬痕和牙齿样本的概率分别为0.99、0.92 和1.00。该研究结果显示，比较口腔链球菌DNA 的高度可区分区域能够将咬痕和对应个体的牙齿进行匹配，在无法回收到足量人类DNA 的情况下，对人体口腔微生物进行分析可提供有价值的信息以佐证其他证据。

3.3 运用口腔微生物进行人物口腔画像

口腔疾病会导致口腔微生物群落结构发生改变。变形链球菌（Streptococcus mutans）和乳酸杆菌（Lactobacillus）被认为是龋齿的特异性病原体[53]，而在其他口腔疾病发生发展过程中，也有特定的口腔微生物参与[3]。LEE 等[54]的研究结果表明，口腔微生物群落中的5 个细菌属在上皮前体病变个体和癌症患者之间有着明显的差异。有学者[55]研究佩戴假牙后口腔微生物群落的变化，结果表明，在佩戴假牙后，口腔微生物群落发生了显著变化，并在此之后保持相对稳定。这些研究表明，口腔疾病以及口腔治疗后的口腔微生物群落会发生变化，可将这一特性用于刻画犯罪嫌疑人的口腔卫生状态。通过对遗留在犯罪现场的口腔相关生物检材进行微生物分析，推断犯罪嫌疑人口腔状态，即处于健康或者疾病状态。若为疾病状态，可进一步推断其患有何种口腔疾病或者是否进行过口腔治疗。这些口腔状态的刻画信息可结合医院的就诊治疗信息，将侦查范围缩小，为案件侦破提供帮助。

微生物法医学在近10 年快速发展，在法医学个体识别运用探索中，大部分研究都以皮肤微生物组为研究对象。唾液作为一种可以遗留在犯罪现场的体液，其微生物组也可提供与犯罪嫌疑人相关的信息。在痕迹DNA 含量低而无法得到可靠DNA 分型结果时，人体口腔微生物组分型就显得尤为有用。口腔微生物群落组成表现出在不同个体之间较大的差异性和同一个体内的时间稳定性。有研究根据口腔微生物分子标记的检测分析，将受试者的牙齿和咬痕成功匹配[52]。遗传因素对人体口腔微生物组的影响小[50-51]这一特性使其在区分同卵双胞胎时较DNA 分型更具优势。人体口腔状态与口腔微生物组成密切相关，可据此刻画人体口腔状态或者个人习惯（如抽烟）[56]等信息，为侦查提供线索。在分析人体口腔微生物时，需要谨记其组成并非一成不变，如服用抗生素后，口腔微生物群落组成会发生变化，正常情况下3 周左右可恢复到之前的状态[57]。口腔和全身疾病以及相应的治疗会导致微生物群落组成发生变化，这一特性既可以提供侦查信息，同时也可能对结果分析造成干扰，在法医微生物研究中需谨慎利用。

4 总结

近年来，分子生物学技术的发展让人们对微生物有了更深层次的认知，对微生物的研究不再局限于分离培养，已向核酸水平和群落研究方向发展，涉及医学、环境学、食品学等多个研究领域。随着测序技术和生物信息学的发展，也使微生物运用于法医学领域成为可能。在法医学实际案件中，口腔微生物可能作为一种生物物证遗留在现场，将犯罪嫌疑人和犯罪现场联系起来，为刑事侦查提供信息。口腔微生物用于法医学个体识别还处于探索阶段，尽管研究已显示出口腔微生物具有法医学个体识别的潜力，但尚存在一些问题，比如缺乏标准化系统、难以对实验结果进行准确解释以及在灵敏度、特异性、稳定性等方面都缺乏研究和验证。另外，如何保证生物检材的微生物群落在采集、保存、运输和检验过程中不受环境微生物的污染，都有待进一步探索。若将口腔微生物分析运用于实际检案中，需建立一种科学、统一且适用性强的分析方法，这可能是今后该领域中的一个研究重点。