羊肚菌的栽培、液体发酵及开发利用研究进展*

朱永乐，高梦祥

（长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434022）

羊肚菌（Morchella spp.）属于子囊菌亚门（Ascomycotina） 盘菌纲 （Discomycetes） 盘菌目 （Pezizales） 羊肚菌科 （Morchellaceae） 羊肚菌属（Morchella）[1]，又名编笠菌、草笠竹、羊肚菜，因菌盖表面生有许多小凹坑，外观极似羊肚而得名[2]。羊肚菌是一种具有重要经济价值的食药兼用大型真菌，因具有较高的商业价值、美丽的外观、药用特性和独特的风味而受到广泛关注[3]。

1 人工栽培的研究

1.1 人工栽培技术

野生羊肚菌驯化难度极高，最初由美国科学家Ower[4]首次开展羊肚菌的人工栽培研究，随后经许多中国科学家的不懈探索，于1993年实现了国内羊肚菌人工栽培的技术突破[5]。如今，大棚栽培以产量更高、风险更小且可以错开时节出菇等优势，成为了目前国内羊肚菌栽培的主要方式[6]。为了倡导绿色健康发展，套种、轮作、沙漠栽培等各种栽培模式也被运用于羊肚菌生产领域[7-9]。

1.2 人工栽培羊肚菌的种类及分布

目前，可实现人工栽培的羊肚菌种类达20余种，其中广泛栽培的品种有六妹羊肚菌（Morchella sextelata）、七妹羊肚菌 （Morchella septimelata）、梯棱羊肚菌 （Morchella importuna）、粗柄羊肚菌（Morchella crassipes） 等[7]。不同的品种各有优劣，不同地区受环境因素影响，适宜栽培的羊肚菌种类也有所差异。羊肚菌是一种中低温菌类，通常在北方栽培较多。贵州省和甘肃省中部的榆中县、陇南市等地气温适宜，因此大多以不耐高温但产量高、品相好的六妹羊肚菌为主[7-9]。四川省的旺苍县和江安县、山东省的淄博市和滕州市以及湖北省等地大面积栽培梯棱羊肚菌，主要原因在于梯棱羊肚菌耐储存和运输，方便销往全国各地[10-14]。西藏自治区、云南省丽江市、山西省等地大规模栽培粗柄羊肚菌[15-17]。而南方沿海地区近几年也开始引进羊肚菌，如浙江省仙居县、嘉兴市于2020年开始栽培羊肚菌；由于南方气温较高，通常选择抗性较强的六妹羊肚菌[18-19]。

2 液体发酵的研究

野生羊肚菌供不应求，人工栽培的推广也存在许多不足之处。例如，羊肚菌栽培技术要求较高，菌核的形成以及出菇管理等关键点难以把握；羊肚菌生长条件苛刻，环境条件控制较为困难；病虫害时有发生；使用大棚栽培前期投入成本高[10，13，20]。而研究发现羊肚菌液体发酵菌丝的活性成分种类与子实体基本相同，且发酵周期短，生产效益高，因此目前许多学者着眼于羊肚菌液体发酵[21]。

2.1 培养基优化

2.1.1 碳源

碳源会影响羊肚菌菌丝体的生长和代谢产物的含量。六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌在麦芽糖培养基中菌丝、菌核生长状态较好，而在蔗糖培养基中长势最弱[22]。在以红糖作为碳源的培养基中，六妹羊肚菌的生物量比对照组增加了112%[23]。此外，碳源中添加生梨50 g和葡萄糖5 g的营养物，六妹羊肚菌菌丝长势更好[24]。以淀粉作为碳源，六妹羊肚菌菌丝在平板培养基上的生长速度最快，为2.43 cm·d-1[25]。以淀粉和乳糖为复合碳源，比仅添加乳糖和淀粉，对羊肚菌菌核与菌丝的生长促进作用更显著[26]。以葡萄糖及玉米粉混合作为天然培养料，比不加玉米粉培养基中的菌丝体干质量增加了51.8%[27]。

2.1.2 氮源

氮源主要分为有机氮和无机氮，在筛选培养基氮源时发现羊肚菌在蛋白胨、黄豆粉、酵母膏等有机氮中均能很好地生长，而在尿素、硫酸铵、硝酸钾等无机氮中生长不良[28]。以酵母膏为氮源时羊肚菌菌丝体生物量比硝酸钾、硫酸铵等作为氮源时平均增加了近50%[29]。氮源为蛋白胨时羊肚菌菌丝体含量显著高于硝酸钾作为氮源时的含量[30]。有机氮对羊肚菌生长的促进作用普遍优于无机氮，其主要原因可能是有机氮中蛋白质比较多，能促进多种酶反应的发生，产生种类丰富的氨基酸；而无机氮源成分比较单一，不利于菌丝体的生长代谢[31]。也有文献报道，硝酸铵、硝酸钠等无机氮作为氮源与有机氮相比，菌丝体干质量无显著差异[23]。造成这种差异的主要原因可能是羊肚菌品种的不同。

2.1.3 金属离子

金属离子是羊肚菌菌丝生长不可或缺的一类物质。通常通过影响跨膜运输、微生物的生理生化反应来调控羊肚菌的生长和次级代谢产物合成。

不同的离子对羊肚菌的影响也不尽相同。适宜浓度的MgSO4能够促进羊肚菌多糖的代谢[32]。孟祥麟等[33]选择梯棱羊肚菌为试验菌株，KH2PO4和Mg－SO4分别按 2 g·L-1的量添加，VB1按 10 mg·L-1的量添加，菌丝生长速率最快。但朱永真等[34]的研究结果发现，KH2PO4对六妹羊肚菌菌丝生长有一定抑制作用，MgSO4的促进作用也不显著，虽然最低离子含量也为0.2 g·L-1，但可能因培养基及菌种的不同而产生了不同。

2.2 发酵条件的确定

羊肚菌的基础发酵条件目前并没有统一的结论，除了供试菌株的不同之外，研究重点不同也是主要原因。多糖、蛋白质等代谢产物开始大量代谢的时间不同，对溶氧量、pH、温度等条件的要求也不相同[35]。羊肚菌菌丝体的适宜生长条件为温度25℃，初始pH为7，接种量为5%，培养时间为5 d[36]。在羊肚菌富硒发酵研究中，当250 mL锥形瓶中装入发酵液100 mL，培养条件为温度24℃、时间5 d、转速100 r·min-1时，硒化蛋白和多糖含量明显增加[37]。在羊肚菌多糖积累发酵研究中，当250 mL锥形瓶中装入发酵液100 mL，发酵条件为温度25℃、pH 6、发酵天数5.98 d、转速217.44 r·min-1时发酵效果最好[38]。研究羊肚菌蛋白质的理化特性时，最佳发酵条件为接种量15%、转速180 r·min-1、温度25℃、培养时间7 d[39]。羊肚菌液体发酵培养产凝集素（蛋白质或糖蛋白）的最优条件为pH 7、温度28℃、培养7 d[40]。综上分析，羊肚菌蛋白质积累需要更长的时间，普遍比菌丝的最佳生长周期多2天左右；且羊肚菌多糖发酵对溶氧量的要求更高。

2.3 诱导因子的研究

微生物所受到的各种诱导因子或信号分子的胁迫，主要分为物理、化学、生物3种诱导方式。关于羊肚菌中运用物理和化学方法进行诱导的相关研究比较多，但关于真菌激发子等生物诱导方法鲜有报道。诱导因子的作用机制一般都是通过激发细胞的防御机制或者影响转录因子的积累，进而影响相关酶基因的表达，最终影响次级代谢产物的产生。

2.3.1 化学诱导

近年来，将生长激素应用于食用菌菌丝的培养，成为了食用菌发酵研究的热点之一。植物激素的作用机理主要分为2种途径：1）通过一些信号通道加快能量转化效率，增加酶的活性促进菌丝生长；2）改变细胞形态，通过细胞延长、拉伸以及加快细胞成熟来增强营养物质的吸收能力。赤霉素GA（gibberellins） 和 α-萘乙酸 NAA （1-naphthlcetic acid）对羊肚菌液体发酵均具有促进作用，对比不加激素的处理，菌丝生长速率增加了26.7%；且GA的促进作用比NAA更明显[41]。熊亚等[42]选择吲哚乙酸IAA（3-Indoleacetic acid）、NAA、VB1、VB2、VB6、VB12、VC、叶酸等作为生长因子，发现添加NAA的促进作用最明显，羊肚菌菌丝体干质量最大可以达到4.7 g·L-1。

除了生长激素之外，一些成分复杂的混合提取液也常作为诱导剂应用于食用菌产业[43]。研究表明，在液体发酵时添加木醋液可显著促进羊肚菌菌丝的生长；与不添加木醋液的对照组相比，生物量最高增加了87.50%[44-45]。中药黄芪的提取液可显著提高羊肚菌深层发酵后菌丝体多糖和胞外多糖的含量[46]。

外源添加代谢途径的中间产物也可以促进菌丝体生长。如研究环腺苷酸cAMP（cyclic adenosine monophosphate）对粗柄羊肚菌菌丝生长和菌核发生的影响时，发现cAMP对菌丝生长作用不显著，但显著抑制菌核发生；而其降解产物腺苷酸AMP（adenine nucleotides）对菌核没有明显作用，但是可以促进羊肚菌的菌丝生长[47]。

2.3.2 物理诱导

物理信号因子诱导不仅刺激微生物生长，还能诱导一些有益代谢产物的积累[48]。舒黎黎等[49]研究发现，混合光源比单光源对羊肚菌的生长更为有利，对子实体的原基形成和生长促进作用显著。

3 主要代谢产物的分离提取

3.1 常用的提取方法

羊肚菌的主要代谢产物有多糖、蛋白质、三萜等，通常通过分离提取获得，以不同物质在不同溶剂中的溶解性不同达到分离的目的。这些提取方法的主要差别在于，采取不同的处理方法提高代谢产物的得率，可达到更好的提取效果。对于羊肚菌多糖的提取，通常先采用丁醇-氯仿除去蛋白沉淀，再通过水提醇沉的方法获得多糖[55]。三萜提取同样依据其溶于醇的特性，先破碎羊肚菌菌丝细胞，继而提取获得三萜[50]。黄酮多酚等功能成分的提取方法也大同小异[51]。影响提取效果的因素主要有提取剂的比例、提取温度、提取时间等。目前，对于各种物质都已经各自形成一套行之有效的提取步骤，当前的研究热点逐渐转到采用适合的辅助手段来提高得率和产物活性。

3.2 辅助提取方法

不同辅助提取方法均可显著地提高产物得率[52]。超声波辅助提取是先用超声波匀浆器粉碎菌丝，再提取羊肚菌多糖，能更好地将胞内产物释放出来，使多糖得率增加了26%[53]。超声辅助热水浸提提取羊肚菌发酵菌丝体三萜化合物，提取量可以达到166 mg·L-1，显著高于对照组[54]。超声-微波协同法UMSE（ultrasonic-microwave synergistic extraction）提取羊肚菌多糖，最适提取条件下多糖得率可达60.17%[54]。与超声辅助萃取法和微波辅助萃取法相比，UMSE的提取效率最高[55]。脉冲电场PEF（pulsed electric fields） 法提取羊肚菌多糖，不仅缩短了提取周期，且具有较高的提取率[56]。

生物酶法可以破碎细胞，或者将大分子先降解为更容易被分离提取的小分子，以提高提取效率。比如用木瓜蛋白酶辅助提取羊肚菌蛋白质水提物MPH（Morchella protein hydrolysate），在最适酶解条件下，制备的MPH活性更好，得率更高[57]。提取羊肚菌的主要呈味物质谷氨酸时，先用外肽酶与外切β-葡聚糖酶进行水解，谷氨酸含量可达20.91 g·kg-1，而且对其他有益成分的损害显著降低[58]。

4 羊肚菌功能成分的研究与开发

4.1 羊肚菌的功能成分与生物活性

从营养角度看，与许多其他真菌一样，羊肚菌中的主要营养成分包括糖类、蛋白质、游离氨基酸、脂肪酸、矿物质、多酚类化合物、生物碱等[59-60]。

4.1.1 羊肚菌多糖

从羊肚菌发酵液和菌丝体中分离得到的功能性多糖具有不同的化学结构，羊肚菌多糖MEP（Morchella esculenta polysaccharides） 多以葡萄糖吡喃基或半乳糖吡喃基链为主，同时还含有甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、n-乙酰氨基葡萄糖等单糖[61-62]。不同菌株、温度、培养基类型、pH、提取方法等，对多糖得率和生物活性均有影响；糖苷键构型、糖残基类型和比例、糖残基连接位点和顺序、分子量等各种差异，导致了羊肚菌多糖化学结构的不同，也影响其生物活性[63]。但是总体来说，MEP具有广泛的生物活性，包括抗肿瘤、抗氧化、抑菌抗炎等[64-66]。

4.1.2 羊肚菌蛋白质

羊肚菌菌丝体中的蛋白质含量丰富，研究人员发现蛋白质提取物具有较强的抗氧化能力[67]。而蛋白质的营养价值与所含氨基酸的类型和数量密切相关。羊肚菌中氨基酸含量高，包括多种必需氨基酸；其中谷氨酸含量最高，其次是天冬氨酸和亮氨酸[68]。还含有几种稀有氨基酸，如顺3-氨基-l-脯氨酸和亮氨酸等，也是构成羊肚菌鲜味的主要成分[69]。

4.1.3 脂肪酸及其他成分

羊肚菌中含有丰富的脂肪酸，以亚油酸、油酸等不饱和脂肪酸为主，占比高达85.38%，能有效防治高血压、高血脂、高血糖、冠心病及肾功能不全等；且具有抗衰老、清除自由基的能力[70-71]。羊肚菌也产生其他几种次级代谢物，包括酶、甾醇、类黄酮、生物碱等[72]。

4.2 羊肚菌产品的开发

4.2.1 初级加工

初级加工主要包括羊肚菌鲜品保鲜处理与干品处理。鲜品的口味最佳，营养价值最高，品相好坏决定价格。个头大、品相好的多用于高档宴席，品质稍次的用于家庭烹饪或中低端市场销售[70]。由于鲜品储存、运输困难，市面上常见多为干制品。不同的干制方法对羊肚菌的破坏程度也不相同，目前常用的是变温烘干法和阶段式冻干法。冻干羊肚菌风味浓郁，冻干法处理的羊肚菌复水性及营养物质保留显著高于烘干羊肚菌，但成本和能耗较高，且操作不便[73-74]。高压静电处理对羊肚菌保鲜和烘干均有明显作用，静电处理可将鲜品的保质期延长至20 d，显著高于对照组，同时其他品质也优于对照。并且由于电场具有常温、干燥的特性，可使干制品最大程度地保留风味成分和形态结构[75]。

4.2.2 精深加工

食用菌精深加工是指通过物理、化学、生化等技术提取食用菌的有效成分，加工成各种产品[76]。目前，比较常见的是以羊肚菌为原料，采用不同的加工工艺与其他材料搭配生产的产品。比如用猪肉和羊肚菌复合制作的羊肚菌肉丸；以羊肚菌、精瘦肉和菜籽油为主要原料制成的羊肚菌肉酱；以羊肚菌为原料制作的酸奶等[77-79]。此外还有用酶处理羊肚菌，以酶解液为底物制备羊肚菌美拉德反应肉味调味基料，将其应用于调味品[80]。但这些产品在本质上是对羊肚菌整体的利用，不适用于羊肚菌液体发酵液。

随着羊肚菌液体发酵产业的逐渐扩大，研究者开始着眼发酵液中具有广泛生物活性的各种物质，尝试将羊肚菌液体发酵产生的功能成分制作为保健食品[81]。如将羊肚菌的膳食纤维应用在固体饮料中，制作了酸、碱2款溶解片，并确定了溶解片的主体配方[82]。通过羊肚菌富硒发酵工艺产生的硒多糖、硒蛋白以及硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸等，为富硒羊肚菌的开发利用提供了新路径[83]。利用羊肚菌菌丝水提液对草莓果实感染灰霉病菌的抑制作用，提高草莓果实对病原菌的抗性和采后品质[84]。

5 展望

我国羊肚菌的人工栽培处于世界领先水平，最早在云、贵、川等地大力发展羊肚菌产业，并逐渐在全国范围推广。但目前还面临着许多困难，如人工栽培技术还不成熟，菌种选育和遗传育种工作难以进行等。可利用原生质体融合等适当手段，培育优良的品种或菌株[85]。

在羊肚菌工厂化发酵方面，研究最多的是对培养基、发酵条件进行优化，以获得目标产物。未来的方向应该是筛选性价比高的大范围工业化培养基原料，并且根据生产目的的不同选择专一性更强的培养基。另外，针对羊肚菌主要代谢产物的外源表达研究较少，在大肠杆菌等模式菌株体内进行生物合成，将是获得羊肚菌独特代谢产物的有效途径。

诱导是常用于液体发酵中扩大产量的方法，目前化学诱导在羊肚菌培养中应用广泛。但是由于对羊肚菌中一些产物的产生机制仍不明确，以外源添加中间产物促进次级代谢产物积累的研究，还依赖于机制研究的进一步突破。在生物诱导方面，微生物的细胞表面结构，如一些膜蛋白，以及菌丝降解物、真菌体外分泌物等，会使细胞内的某些基因得到表达，从而激活某些次生代谢途径，这方面的研究在羊肚菌液体发酵领域还未见报道。物理诱导方法如光照、变温发酵等，目前只有零星报道，超声、磁场、电场等辅助手段目前还没有运用于羊肚菌发酵。由于物理诱导具有无污染、绿色环保等优点，未来可进一步开展相关研究。同时，因微波、电场等措施能在不降低提取效率的基础上最大限度保留原有成分的生理生化特性，能够为羊肚菌主要成分提取中存在的产物得率低、活性损失等问题提供解决方法。综上可以看出，物理手段的合理运用将成为羊肚菌研究领域的一个重要研究方向。

羊肚菌是一种食药兼用的真菌，目前主要作为食品受到大众喜爱，比如羊肚菌调味品、饮料、酱制品等，在市面上均有售卖。而其药用功能，如降血脂、减轻因放疗、化疗引起的副作用等，尚停留在实验室研究阶段，很少有相关药品出现在大众视野。因此，对其药用成分进行深入研究，开发疗效好、副作用小的新药，并深入探索药用成分的结构，进行化学合成，加快羊肚菌下游产品的开发进程，具有广阔的商业前景。此外，羊肚菌发酵液的主要成分还具有抗衰老的作用，可以改善皮肤状态，提高皮肤细胞活力。可以预见，羊肚菌发酵液作为化妆品原料在化妆品领域也有广阔的应用前景。