膀胱癌中Yes相关蛋白表达与Wnt/β⁃catenin通路的关系及其临床病理意义

李建军 喻长莉

膀胱癌是一种发病率较高的泌尿系恶性肿瘤，虽然手术切除、灌注化疗等治疗手段取得了一定疗效，但治疗后容易发生复发及转移，预后不佳、5年生存率低［1⁃2］。目前，膀胱癌的发病机制尚不完全清楚，临床上也缺乏评估病情及预后的分子标志物及靶向治疗的分子靶点。Yes 相关蛋白（Yes⁃associated protein，YAP）参与细胞内信号转导及基因表达调控，在多种恶性肿瘤发病中起重要作用。一项膀胱癌相关的细胞实验证实，敲低膀胱癌细胞T24 中YAP 的表达后，癌细胞的增殖活力降低且细胞中Wnt/β⁃连环蛋白（β⁃catenin）通路受到明显抑制［3］，提示YAP 可能通过Wnt/β⁃catenin 通路参与膀胱癌的发病，但YAP 在膀胱癌中的作用尚缺乏临床证据。因此，本研究将以膀胱癌患者为对象，分析膀胱癌中YAP 表达与Wnt/β⁃catenin 通路的关系及其临床病理意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2017年1月至2018年12月期间在湖北省武汉市江夏区中医医院接受手术切除的膀胱癌患者作为研究对象，同时取癌旁距离≥5 cm 的正常组织为对照组。纳入标准：①接受手术治疗，术后病理诊断为膀胱癌［4］；②术前未接受过放化疗或其他抗肿瘤治疗；③临床病理资料及随访资料完整；④取得知情同意。排除标准：①既往有其他恶性肿瘤病史；②合并免疫功能异常、精神类疾病等。共纳入108 例患者，年龄平均（61.49±11.82）岁，男性78 例、女性30 例，病理分级Ⅰ级19 例、Ⅱ级24 例、Ⅲ级65 例。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 免疫组化染色及结果判定

取膀胱癌组织及癌旁组织，制作石蜡切片后采用SP 二步法免疫组化染色试剂盒（北京杰辉博高生物公司）对YAP、Wnt1、Wnt3a、β⁃catenin 进行免疫组化染色，YAP 一抗为Abcam 公司、稀释比例1∶200，完成免疫组化染色后进行苏木素复染，封片并在显微镜下观察。根据染色强度及阳性细胞比例进行结果判定［4］。染色强度：无染色为0 分、黄色染色为1 分、棕黄色染色为2 分、棕褐色染色为3分；阳性细胞比例：无染色为0 分，1%～25%阳性为1分、26%～50%阳性为2 分、51%～75%阳性为3 分，>75%阳性为4 分。将染色强度积分与阳性细胞比例积分相乘，乘积1～4 分为低表达、5～12 分为高表达。

1.3 荧光定量PCR 检测mRNA 表达水平

取膀胱癌组织及癌旁组织，采用RNA 提取试剂盒（北京天根生化公司）提取RNA，采用cDNA 合成试剂盒（北京天根生化公司）对RNA 进行反转录、合成cDNA，采用荧光定量PCR 试剂盒（北京天根生化公司）进行cDNA 样本中YAP、Wnt1、Wnt3a、β⁃catenin 表达水平的检测，分别对YAP、Wnt1、Wnt3a、及进行荧光定量PCR 扩增，得到扩增的循环曲线及循环阈值（cycle threshold，CT），以β⁃actin为 内参、按照公式2⁃ΔΔCt计算YAP、Wnt1、Wnt3a、β⁃catenin的mRNA 表达水平。

1.4 预后的随访

采用门诊复查、电话回访等方式进行随访，截止时间为2021年5月31日，随访内容为疾病进展情况和生存情况，计算无进展生存期和总生存期。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件和Prism6.0 软件进行统计学分析，计数资料以n（%）表示，行χ2检验，计量资料以（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，无进展生存期和总生存期采用K⁃M 曲线描述、采用log⁃rank 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织及癌旁组织YAP 表达水平的比较

膀胱癌组织的YAP 高表达率及mRNA 表达水平均高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、表1。

表1 膀胱癌组织及癌旁组织YAP 表达水平的比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of YAP expression level in bladder cancer tissues and adjacent tissues［n（%），（±s）］

表1 膀胱癌组织及癌旁组织YAP 表达水平的比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of YAP expression level in bladder cancer tissues and adjacent tissues［n（%），（±s）］

组织来源膀胱癌组织癌旁组织χ2/t 值P 值n 108 108 YAP 高表达率76(70.37)36(33.33)29.670 0.000 YAP mRNA 表达水平2.42±0.45 1.00±0.21 29.717 0.000

图1 膀胱癌组织及癌旁组织YAP 病理图（SP，×400）Figure 1 Immunohistochemical staining of YAP in bladder cancer tissues and adjacent tissues（SP，×400）

2.2 膀胱癌YAP 低表达与高表达患者临床病理特征的比较

膀胱癌YAP 低表达与高表达患者性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），膀胱癌YAP 高表达患者病理分级Ⅲ级、T3⁃T4 期、淋巴结转移的比例高于YAP 低表达患者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 膀胱癌YAP 低表达与高表达患者临床病理特征的比较［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of clinicopathological features between low expression and high expression of YAP in bladder cancer［n（%），（±s）］

表2 膀胱癌YAP 低表达与高表达患者临床病理特征的比较［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of clinicopathological features between low expression and high expression of YAP in bladder cancer［n（%），（±s）］

临床病理特征性别年龄病理分级T 分期淋巴结转移男女<60 岁≥60 岁Ⅰ～ⅡⅢT1～T2 T3～T4否是YAP 蛋白表达高表达56（71.79）20（66.67）34（73.91）42（67.74）24（55.81）52（80.00）26（59.09）50（78.13%）39（61.90）37（82.22）低表达22（28.21）10（33.33）12（26.09）20（32.26）19（44.19）13（20.00）18（40.91）14（21.88）24（38.10）8（17.78）χ2值0.2730.601 0.4820.487 7.2610.007 4.5310.033 5.1970.023 P 值

2.3 YAP 低表达与高表达的膀胱癌组织中Wnt/β⁃catenin 通路的比较

YAP 高表达的膀胱癌组织中Wnt1、Wnt3a、β⁃catenin的mRNA 表达水平高于YAP 低表达的膀胱癌组织，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 YAP 低表达与高表达的膀胱癌组织中Wnt1、Wnt3a、β⁃catenin mRNA 表达水平的比较（±s）Table 3 Comparison of mRNA expression of Wnt1，Wnt3a，β⁃catenin between low expression and high expression of YAP in bladder cancer tissues（±s）

表3 YAP 低表达与高表达的膀胱癌组织中Wnt1、Wnt3a、β⁃catenin mRNA 表达水平的比较（±s）Table 3 Comparison of mRNA expression of Wnt1，Wnt3a，β⁃catenin between low expression and high expression of YAP in bladder cancer tissues（±s）

YAP 蛋白表达低表达高表达t 值P 值n 32 76 Wnt1 1.67±0.31 2.09±0.32 6.285 0.000 Wnt3a 1.58±0.34 2.11±0.39 6.688 0.000 β⁃catenin 1.52±0.30 2.18±0.41 8.218 0.000

2.4 膀胱癌YAP 低表达与高表达患者无进展生存期及总生存期的比较

膀胱癌YAP 高表达患者随访过程中的累积无进展生存率及累积总生存率均低于膀胱癌YAP 低表达患者，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

图2 膀胱癌YAP 低表达与高表达患者无进展、总生存期的K⁃M 曲线Figure 2 K⁃M curve of progression free and overall survival in patients with low YAP expression and high expression of bladder cancer

3 讨论

YAP基因是近些年受到越来越多关注的原癌基因，该基因的编码产物含有WW 结构域、是Hippo 信号通路的核心蛋白，在细胞内对多种信号通路的激活及基因的表达具有调控作用。国内外多项临床研究证实，肺癌［4］、胰腺癌［5］、乳腺癌［6］等多种恶性肿瘤组织中YAP 的表达水平明显增加，提示YAP 具有促癌作用。膀胱癌中YAP 相关的研究仍处于细胞实验阶段，国内刘邦俭［3］、董锐［7］及Chen X［8］的细胞实验均证实敲低YAP 显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭，提示YAP 可能在膀胱癌的发病中起促癌作用。本研究通过临床样本的收集及检测证实：膀胱癌组织中YAP 的表达水平较癌旁组织明显增加，结合既往其他学者在细胞实验中证实YAP 促进膀胱癌细胞生长的生物学效应进行分析，局部组织中高表达的YAP 可能参与膀胱癌的发病。

膀胱癌具有浸润性生长的生物学特性，不断浸润的膀胱癌细胞促进了病理进展。癌细胞异常的增殖、迁移及侵袭是与膀胱癌浸润性生长密切相关的生物学行为，YAP 已经被证实显著促进膀胱癌细胞的增殖、迁移及侵袭，但其与膀胱癌病理进展的关系尚不清楚。Marquard S［9］在肝癌中的研究及Li J［10］在头颈部恶性肿瘤中的研究分别证实YAP 的高表达与两种恶性肿瘤的病理进展有关。本研究分析了膀胱癌发病过程中YAP 与病理特征的关系。根据YAP 的免疫组化染色检测结果将其分为高表达和低表达，与膀胱癌YAP 低表达的患者比较，YAP 高表达患者的病理分级、T 分期及淋巴结转移率均更高，表明YAP 表达增加与膀胱癌的病理进展有关，进而验证了高表达的YAP参与膀胱癌的发病。

膀胱癌相关的细胞实验证实，YAP 的促癌作用与激活Wnt/β⁃catenin 通路有关［3］，这一作用也在胃癌［11］、肝癌［12］、黑色素瘤［13］、宫颈癌［14］中被证实。Wnt/β⁃catenin 通路是经典的促癌通路，上游信号分子Wnt1、Wnt3a 与受体Frz、LRP5/6 结合后向细胞内传递信号、使β⁃catenin 在细胞质内聚集并向细胞核转位，进入细胞核的β⁃catenin 能调控多种原癌基因表达、促进细胞生长。Chehrazi⁃Raffle A 的研究证实，Wnt/β⁃catenin 通路的激活对膀胱癌细胞的生长具有促进作用［15］。本研究通过临床样本的检测对膀胱癌发病过程中YAP 与Wnt/β⁃catenin 通路的关系进行了验证，与YAP 低表达的膀胱癌比较，YAP 高表达的膀胱癌中Wnt1、Wnt3a 及β⁃catenin的表达均明显增加，提示高表达的YAP 可能通过激活Wnt/β⁃catenin 通路参与膀胱癌的发病。

最后，本研究还对膀胱癌的预后进行了随访。目前关于膀胱癌预后的研究认为，病灶浸润、淋巴结转移等病理特征是预后的影响因素［16⁃18］，本研究已经证实YAP 的高表达与T 分期、淋巴结转移有关，进一步分析YAP 表达水平与预后的关系可知：YAP 高表达患者随访过程中的累积无进展生存率及累积总生存率均明显降低，表明YAP 的高表达与膀胱癌患者预后不佳、生存时间缩短有关，由此也为深入认识YAP 在膀胱癌发病中的作用提供了临床随访证据。

综上所述，膀胱癌中YAP 表达水平增加与Wnt/β⁃catenin 通路激活及病理进展、生存时间缩短有关，上述结果为今后深入研究YAP 在膀胱癌发病中的作用及机制提供了依据。