蛋白酶抑制剂BMS-345541和MG-132对人脑胶质瘤细胞凋亡及活力的影响*

周保丹，李 君，高 飞，乔卿均，董 辉

1.河南省南阳市第二人民医院神经外科，河南南阳 473000；2.南阳医学高等专科学校第一附属医院神经内科，河南南阳 473000

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤。目前，胶质瘤的病因并不十分明确，但可能与遗传因素、环境因素、电离辐射、病毒感染等有关[1]。胶质瘤约占中枢神经系统原发性恶性肿瘤的80%，基本上无法治愈[2-3]。胶质瘤有很强的侵袭性和破坏性，复发率高，治疗方法有限[4]。胶质瘤患者的治疗模式包括手术后联合放疗和化疗，尽管给予了积极治疗，但生存率还是很低，严重威胁了患者的生命[5]。蛋白酶抑制剂可以抑制蛋白酶的活性，目前主要用于治疗艾滋病，它可以与病毒蛋白酶催化基因结合抑制酶活性，从而导致蛋白前体不能裂解及形成成熟病毒。蛋白酶抑制剂也可以治疗恶性肿瘤，它可以阻断癌细胞内蛋白酶分解蛋白的功效，让癌细胞内的蛋白不断积累，最后会引起恶性细胞死亡，尤其对于多发性骨髓瘤及胶质母细胞瘤效果较好。BNS-345541和MG-132是两种不同的蛋白酶抑制剂，本研究主要探讨蛋白酶抑制剂BMS-345541和MG-132对人脑胶质瘤细胞凋亡及活力的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人脑胶质瘤细胞15株(SHG-44，中国科学院上海生物细胞生物研究所提供，批号：20190509)，将15株人脑胶质瘤细胞分成3组，分别为对照组、BMS-345541组和MG-132组，每组5株。

1.2仪器与试剂 CO2培养箱(Bio-Rad公司，型号：BPN-150CH(UV)；显微镜(上海光学仪器厂，型号：LJ-TS01)；Trizol试剂(美国Thermo公司，批号：20180421)；BMS-345541抑制剂(美国SD公司，批号：SH30022)；MG-132抑制剂(美国SD公司，批号：SH30256)；胎牛血清(Gibco公司)。

1.3方法

1.3.1SHG-44细胞传代培养 将SHG-44细胞放入培养液中，在培养液中加入胎牛血清、青霉素和链霉素，最后将培养液放置于37 ℃的CO2培养箱中。将对照组细胞进行传代培养；BMS-345541组在细胞培养液中加入BMS-345541进行传代培养；MG-132组在细胞培养液中加入MG-132进行传代培养。

1.3.2测量细胞数量 取一定量的细胞悬浮液，将盖玻片安放在计数室上面，摇匀细胞悬浮液，转至高倍镜后，适当调节光度，使细胞和计数室线条均清晰，然后将计数室一角的中格移至视野中，通常以计5个中格的细胞值来代表计数室中的细胞数量。计数时为了避免重复或遗漏，分布在各线上的细胞，一律以接触方格底线和右侧线上的细胞作为本格内的细胞数。

1.3.3MTT比色法检测各组细胞活力 吸取各组SHG-44细胞悬液(对数生长期，每孔1×105细胞)分别加入96孔板，BMS-345541组加入蛋白酶抑制剂BMS-345541，MG-132组加入蛋白酶抑制剂MG-132，然后每孔加入10 μL MTT溶液，培养4 h后终止培养，加入二甲基亚砜(DMSO)充分振荡，溶解生成结晶紫，用酶标仪检测波长为490 nm处的吸光度值(A值)，最后计算SHG-44细胞的活力。

1.3.4流式细胞仪检测各组细胞凋亡率 采用Annexin V-FITC/PI双标记染色法，用胰酶消化贴壁细胞，先用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，再重悬成单细胞悬液，加入Annexin V-FITC、PI试剂及Binding Buffer，轻轻混匀，在室温下避光反应15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.5荧光定量PCR法检测GRP78 mRNA的相对表达量 将各组加入Trizol试剂提取总RNA,分光光度计检测GRP78 mRNA水平及纯度，A260/A280均在1.8～2.1。最后计算GRP78 mRNA相对表达量。

1.3.6蛋白质免疫印迹法检测蛋白表达水平 取样品蛋白质30 μg用十二烷基磺酸钠 (SDS)-聚丙烯酰胺 (PAGE) 电泳分离，将蛋白条带用半干电转膜仪转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，再用5%的小牛血清清蛋白封闭。最后置于图像分析系统行扫描及分析，计算蛋白表达水平。

2 结 果

2.13组细胞数量比较 对照组、BMS-345541组、MG-132组细胞数量分别为(730 000±154)、(257 000±256)、(210 000±333)个，BMS-345541组和MG-132组的细胞数量明显少于对照组，且MG-132组的细胞数量明显少于BMS-345541组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.23组细胞活力和细胞凋亡率比较 BMS-345541组和MG-132组细胞活力明显低于对照组，细胞凋亡率明显高于对照组，MG-132组的细胞活力高于BMS-345541组，细胞凋亡率低于BMS-345541组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 3组细胞活力和细胞凋亡率比较

2.33组细胞GRP78 mRNA表达比较 对照组、BMS-345541组、MG-132组的细胞GRP78 mRNA表达水平分别为(2.21±0.08)%、(15.98±1.58)%、(13.55±1.12)%，BMS-345541组和MG-132组的细胞GRP78 mRNA表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.43组细胞蛋白表达水平比较 BMS-345541组和MG-132组GRP78、JNK1蛋白表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2和图1。

表2 3组细胞蛋白表达水平比较

图1 3组细胞蛋白质电泳图

3 讨 论

胶质瘤细胞由正常细胞突变而来，并表现为生长失控，形成胶质瘤后会引起多种神经系统症状，主要表现为头痛、癫痫发作、喷射状呕吐、视物模糊、感觉丧失、乏力、口吐白沫、四肢抽搐等症状。胶质瘤若没有得到及时诊断和治疗，随病情进一步发展，可能出现颅内压升高、认知功能障碍等并发症[6]。蛋白酶体系是一种多价复合酶，具有催化活性，细胞依赖蛋白酶体系可清除不利于自身的异常蛋白，肿瘤细胞亦是如此，蛋白酶抑制剂可诱导肿瘤细胞凋亡，其在乳腺癌和前列腺癌中的作用已得到证实。

蛋白酶抑制剂BMS-345541是一种新型抑制剂，以剂量依赖性方式抑制IKK-2和IKK-1。BMS-345541在高达100 μmol/L的浓度下不能抑制丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸激酶，且未能阻断茴香霉素刺激的c-Jun磷酸化和脂多糖(LPS)刺激的THP-1细胞中MAPKAP K2的激活，以及内皮生长因子(EGF)刺激的H292细胞中STAT3的磷酸化。BMS-345541处理导致SK-MEL-5、A375和Hs 294T细胞中黑色素瘤细胞增殖的浓度依赖性抑制[7]。TUNEL染色和核浓缩技术显示BMS-345541具有细胞凋亡作用，此药物具有作为新型抗肿瘤药物的潜在价值[8]。本研究结果显示，BMS-345541组的人脑胶质瘤细胞数量少于对照组，细胞活力明显低于对照组，细胞凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明蛋白酶抑制剂BMS-345541对人脑胶质瘤细胞具有抑制作用，可降低其细胞活力，这与以往的研究具有相同的结果。

MG-132是一种可透过细胞的蛋白酶抑制剂，属于合成肽醛类抑制剂[9]，能够抑制不同类型蛋白酶的活性，包括丝氨酸蛋白酶、钙蛋白酶等。MG-132和其他肽醛类抑制剂可以有效抑制蛋白酶体系多个肽酶的蛋白酶活性，并能抑制钙蛋白酶的活性。它通过26S复合物降低哺乳动物细胞和酵母可渗透菌株中泛素-共轭蛋白的降解，而不影响其ATP酶或肽酶活性。蛋白酶体系是细胞功能不可分割的一部分。MG-132与其他蛋白酶抑制剂一样，对细胞和组织是有毒的，使用浓度过高或治疗时间过长会导致细胞死亡。可取的做法是选择稀释>1 000倍的最适浓度。最适浓度不仅与细胞类型有关，也取决于细胞培养参数，如细胞饱和度、血清水平、培养基成分。MG-132可用于诱导细胞凋亡和自噬的机制研究，它可以通过干扰肿瘤细胞的周期，阻止其无限增殖，尤其可以选择恶性程度高的肿瘤细胞首先发挥毒性作用。MG-132是一种天然的蛋白酶抑制剂，目前的研究已经证明MG-132能够对肝癌细胞发挥毒性作用[9]。本研究显示，MG-132组的人脑胶质瘤细胞数量少于对照组，细胞活力明显低于对照组，细胞凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明蛋白酶抑制剂MG-132对人脑胶质瘤细胞具有抑制作用，可降低其细胞活力。

综上所述，蛋白酶抑制剂BMS-345541和MG-132可以诱导人脑胶质瘤细胞的凋亡，可增强患者疗效。