疏血通注射液对急性肺栓塞大鼠的保护作用及对细胞凋亡的影响

张胜碧 刘燕玲 徐俪颖

1.温州市中医院药剂科，浙江温州 325000；2.金华市中医医院中药房，浙江金华 321017；3.浙江省中医院呼吸内科，浙江杭州 310000

急性肺栓塞（acute pulmonary embolism，APE）是内源性或外源性栓子阻塞致肺循环受阻的一种临床综合征，影响APE 患者身心健康[1]。西药效果好，但有不良反应[2]，中西联合可提高治疗效果，减少不良反应[3]。

疏血通注射液由水蛭、地龙制成[4]，用于急性脑梗死患者的治疗[5-6]。动物研究表明其能抑血栓形成，促血栓溶解[7]。临床发现其可有效改善患者微循环[8]，但机制不清楚。因此，本研究建立APE 模型，探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 雄性7 周龄SD 大鼠75 只，体重（250±20）g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（沪）2013-0016，浙江中医药大学实验动物研究中心饲养，动物使用许可证号SYXK（浙）2018-0012。本研究参照中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会执行标准。

1.2 试剂与仪器

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒，货号：A001-3-2、A044-1-1、A005-1-2，南京建成生物研究所；疏血通注射液，批号：14040121，中国牡丹江友搏药业有限责任公司；Bcl-2，货号：AF6139，Affinity。Bax、Caspase-3、β-actin抗体，货号：2772、9662、4967，CST。Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP），货号：ab6721，Abcam。

Micro17R 低温高速离心机（赛默飞）；AE2000 显微镜（Motic 实业集团）；Tanon-1600 凝胶成像仪（天能集团）。

1.3 模型制备

75 只SD 大鼠适应喂养1 周，将其按照随机数字表法分为假手术组，模型组，疏血通低、中、高剂量组，每组各15 只。无菌条件下眼眶静脉取血，静置4 h 凝固，制成血栓栓子（1.1 mm×2.0 mm），加入2 ml 生理盐水制成血栓混悬液，4℃冷藏备用。腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定，左颈部剪毛消毒，行纵行切口，分离颈外静脉，插入导管针至肺动脉，注入血栓混悬液约30 个栓子，缝合切口，当大鼠呼吸加快加深时，即APE 模型建立成功[9]。假手术组注入等量生理盐水。造模前2 h，疏血通低、中、高剂量组分别皮下注射0.25、0.5、1 ml/kg 的疏血通注射液；假手术组和模型组均皮下注射等体积二甲基亚砜（Dimethy sulfoxide，DMSO）[10]。

1.4 平均肺动脉压 （mean pulmonary arterial pressure，mPAP）、右心室压力（right ventricular pressure，RVP）测定

所有大鼠血栓4 h 后，戊巴比妥钠麻醉，分离右侧颈外静脉，插入聚苯乙烯管0.9 mm 内径测定并记录。

1.5 血气分析

所有大鼠处死前颈动脉插管，取5 ml 血置抗凝管，采用全自动血气分析机进行血气分析，检测指标包括动脉血氧分压（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）和动脉血二氧化碳分压（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）的水平。

1.6 肺脏病理检测

处死大鼠后分离肺组织，置10%甲醛固定，石蜡包埋，切片。HE 染色，显微下观察并记录组织病理情况。

1.7 肺湿干重比

取右肺组织称重后，在80°C 恒温烘箱中干燥24 h，再称重。两次重量比作为肺湿干重比的指标来评价组织水肿。

1.8 氧化应激指标检测

按试剂盒说明，采用WST-1 法测定肺组织SOD、MPO、GSH 活性。

1.9 TUNEL 检测细胞凋亡

取大鼠肺组织切片，根据试剂盒操作说明行TUNEL染色检测细胞凋亡情况，并于显微镜下拍照观察。

1.10 Western blot 检测Bcl-2、Bax、Caspase-3 的蛋白表达

BCA 法测定肺组织蛋白浓度，电泳，转PVDF 膜；将膜置于含5%脱脂奶粉的封闭液中摇床振荡1.5～2.0 h 后TBST 洗3 次，随后分别采用兔抗大鼠Bcl-2 抗体（稀释1∶2000）、Bax 抗体（稀释1∶2000）、Caspase-3 抗体（稀释1∶500）于4℃摇床振荡封闭过夜，再加入二抗Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（1：2000）孵育2 h，洗膜，ECL 化学发光显影，用Image J 软件分析蛋白条带。

1.11 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用One-way-ANOAY 分析，组内比较采用SNK-q检验，方差不齐者采用Kruskal-Wallis H 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠mPAP、RVP 水平比较

与假手术组比较，模型组mPAP、RVP 水平升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；与模型组比较，疏血通中、高剂量组mPAP 水平降低，疏血通高剂量组RVP 水平降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与疏血通低剂量组比较，疏血通中、高剂量组mPAP 水平均降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1。

2.2 各组大鼠动脉血气分析结果比较

与假手术组比较，模型组PaO2水平显著降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；与模型组比较，疏血通高剂量组PaO2水平升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。各组之间PaCO2水平比较，差异无统计学意义（P >0.05）。见图2。

2.3 各组大鼠肺脏病理检测结果比较

假手术组大鼠肺组织切片中没有明显的病理性损伤；在进行血栓栓子处理引发肺部栓塞后，模型组大鼠肺切片中能观察到肺泡内和间质水肿，肺组织损伤严重，而疏血通高、中、低剂量组大鼠肺组织则呈现一定的肺组织损伤改善，其中以高剂量组改善情况更明显。见图3。

2.4 各组大鼠肺湿干重比比较

与假手术组比较，模型组肺湿干重比升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；与模型组和疏血通低剂量组比较，疏血通高剂量组肺湿干重比均降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图4。

2.5 各组大鼠肺组织SOD、MPO、GSH 活性水平比较

与假手术组比较，模型组SOD、GSH 活性水平降低，MPO 活性水平升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；与模型组比较，疏血通中、高剂量组SOD 活性水平升高、MPO 活性水平降低，疏血通高剂量组GSH活性水平升高，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01），与疏血通低、中剂量组比较，疏血通高剂量组MPO 活性水平均降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01），与疏血通低剂量组比较，疏血通高剂量组GSH 活性水平升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图5。

2.6 各组大鼠组织细胞凋亡情况比较

假手术组几乎无细胞凋亡。模型组出现大量细胞凋亡；疏血通低剂量组细胞凋亡情况有所缓解，疏血通中、高剂量组凋亡情况改善明显。见图6。

2.7 各组大鼠肺组织蛋白表达水平比较

与假手术组比较，模型组肺组织中Bax、Caspase-3蛋白的表达水平升高，Bcl-2 蛋白的表达水平降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；与模型组比较，疏血通中、高剂量组肺组织中Bax 蛋白表达水平降低，Bcl-2 蛋白的表达水平升高，疏血通高剂量组肺组织Caspase-3 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与疏血通低剂量组比较，疏血通高剂量组肺组织Bax、Caspase-3 蛋白表达水平降低，Bcl-2 蛋白的表达水平升高，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。与疏血通中剂量组比较，疏血通高剂量组肺组织Bax 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图7。

3 讨论

肾病综合征患者APE 发病率可达59.3%，阻碍气体交换，加剧血管收缩[11-13]。本研究用自体血栓栓塞并采用改良的经颈静脉栓塞法，减少了排异反应，缩短了栓子运行距离，确保大鼠栓塞程度的均一性，有助于实验结果更加准确[14-15]。模型组mPAP、RVP 水平上升，而PaO2降低，提示APE 发生后机体会发生肺部血流动力学障碍，分析原因可能是机体损伤后体内炎症因子大量聚集，损伤心肌组织，造成血栓性动脉高压[16]。而疏血通高剂量组mPAP、RVP 水平下降，提示疏血通注射液可有效降低肺动脉压力，可能是其有效成分能减少肺动脉平滑肌增殖，抑制肺动脉重建[17-18]。疏血通高剂量组的肺湿干重比显著低于模型组，提示疏血通注射液可以改善肺组织水肿情况，且呈浓度依赖性[19]。

维持机体自由基的平衡依赖于氧自由基清除酶系统，组织缺血，氧自由基清除能力降低。APE 患者机体氧化/抗氧化失衡，自由基过多，加之大量活性氧产物生成，造成肺组织损伤，而当疏血通注射液处理后，SOD、GSH 含量升高，提示疏血通注射液可以激活氧自由基清除酶系统活性，发挥抗炎抗氧化作用，减少超氧阴离子对肺组织的损伤[20]。

Caspase-3 可剪切PARP，引起细胞凋亡[21-23]。Bax为与Bcl-2 同源的水溶性蛋白，可促进细胞凋亡，Bcl-2 蛋白对细胞具有保护作用，可通过调节线粒体膜通透性等组成性表达减弱Bax 介导的Cyt-C 释放，同时可抑制Caspase 激活凋亡途径，Bax 的过度表达同样可拮抗Bcl-2 的保护效应，使细胞凋亡[24-27]。TUNEL 检测显示疏血通高剂量组细胞凋亡显著降低，Bax、Caspase-3 表达下降，Bcl-2 蛋白的表达水平上升，这与马璐璐等[28]的研究结果相符，提示疏血通注射液可有效抑制细胞凋亡，可通过上调Bcl-2 蛋白表达，降低Bax、Caspase-3 表达，起到抑制细胞凋亡的作用。

综上所述，疏血通注射液对APE 大鼠具有一定的保护作用，且其保护作用可能是通过降低Bax、Caspase-3 蛋白表达，提高Bcl-2 蛋白表达活性来实现的。