基于人工基质的着生藻类测定方法探讨

严 飞，朱冰川，徐 赕

(江苏省无锡环境监测中心，江苏 无锡 214000)

1 引言

河流水质主要从理化指标、水生生物、生境状况等角度评价[1]。现有环境下物理和化学监测技术已经较为成熟，对污染物已经可以进行快速完善的测定，但环境中的污染物并非单独存在，环境受到污染后的影响非常复杂也难以进行快速鉴定，因此根据水生生物对水体污染快速反应的特点，可以进行水环境污染的及时预警。水生生物的研究近年来越发重要，河流中藻类主要分为着生藻和浮游藻两大类,着生藻类是水体中的初级生产者[2]。着生藻类是生长在水下各种基质表面上的所有藻类[3]，是水生态系统重要组成部分[4]，但着生藻类的研究报道较少[5]。着生藻类生物完整性指数的水生态健康评价技术在国外得到广泛应用[6]。

着生基质是研究着生藻类工作的基本材质，按照采样基质的不同，对着生藻类的研究可以分为天然基质法和人工基质法。天然基质法是指采集位于水下的鹅卵石、碎石、高等水生植物、大型藻类、枯枝落叶等，并从其上刮取着生藻类，或用培养皿扣去河床上细沙、沉积物得到藻类的方法到藻类的方法[7]。受天然基质的局限性,对着生藻类的深入研究有限，而人工基质主要有载玻片、瓷砖、人工水草等[8]，本文以标准面积和可知时间的人工基质探讨着生藻类的测定。由于对人工基质尚未有统一的使用标准,本次实验主要对着生藻类的定性、定量监测结果以及精密性等进行分析探讨，对样品处理和鉴定计数采用常规制片法(非硅藻样品)和改进的计数方法[9]。

2 方法原理

利用人工基质(放置一段时间，让藻类能附着生长)和天然基质采集水中着生藻类，对采集的样品进行固定、浓缩，抽取样品在显微镜下进行着生藻类的定性和定量，其中通过生物个体计数来表征单位面积藻类个体数量(藻类密度)，利用形态学对物种进行定性鉴定。

3 仪器设备、试剂和材料

3.1 设备器材

毛刷、镊子、刀片、剪刀、样品瓶(250 mL)、标签纸、丙烯酸缆绳、硅藻计(由本中心提供技术参数进行定制，载玻片尺寸2.5 cm×7.7 cm，一共8 片，总面积为300 cm2，无站内编号)，配备10×目镜和20×、40×、100×(油镜)物镜的生物显微镜(型号：NIKON80i，站内编号：AGS001，校准日期：2018年6月11日，有效期为1 年，检定校准证书见附件10)，载玻片及盖玻片、浮游生物计数框、移液枪、一次性枪头、记号笔、胶头滴管、乳胶手套及一般实验室常用仪器和设备。

3.2试剂药品

(1)固定剂。鲁哥氏液：40 g碘(含量≥99.8%，分析纯)溶于含碘化钾(含量≥99.0%，分析纯)60 g的1000 mL水溶液中；福尔马林：市售40%的甲醛溶液(甲醛含量37.0%～40.0%，分析纯)。

(2)实验用水。蒸馏水：新制备的超纯水。

4 样品的采集与保存

本次方法确认于2019年3月12日在梁南桥点位开始放置人工基质(硅藻计)1 个，每天查看，以确保硅藻计不丢失。3月26日收集样品(人工基质定性、定量样品1个，天然基质定性样品1个)，共计2个(采样记录见表1)。

表1 采样记录

4.1 样品采集

4.1.1 定量样品—人工基质法

本次实验采用人工基质硅藻计，在河流采样中避开急流和漩涡，采样时固定好器材，保证硅藻计距离水面5～10 cm，使之得到合适的光照，每天观察了解采样器材放置情况，在放置14 d后进行着生藻类的采集，采集过程中将硅藻计从水中缓慢移出，用毛刷和刀片将载玻片表面上所有附着的着生藻类全部刮到盛有蒸馏水的玻璃瓶中，并用蒸馏水将基质冲洗多次，用鲁哥氏液固定，贴上标签。此次方法确认采用直接加入鲁哥氏液固定来定量鉴定着生藻类。

4.1.2 定性样品—天然基质法

采集天然基质上的着生藻类样品，本次实验中采集基质为卵石(85%)、树木残干(15%)，采集过程中将基质从水中缓慢移出，将表面相对较为光滑和略带绿色、蓝绿色或棕黄色的部分用刀片刮取到装有少量蒸馏水的样品瓶中。将所有采集到的样品混合装入样品瓶中，加入甲醛溶液，贴上临时标签。

4.2 样品固定和保存

(1)定性样品固定：按100∶3的比例在样品中加入市售的甲醛溶液。

(2)定量样品固定：按100∶1.5的比例在样品中加入配好的鲁哥氏液，鉴定完成后按定性样品固定液的比例加入甲醛溶液永久保存。

(3)将样品放入密封的样品瓶中，置于统一的样品柜中保存。

4.3 标识与记录

(1)标识。在样品瓶上粘贴标签，标注采样地点、日期、采集人姓名、固定液类型。在样品记录本上记录与样品编号相对应的采样地点、日期与样品类型。

(2)记录。在着生藻类采样记录表中记录河流名称、采样位置、采样日期、采集人姓名、采样方法及相关生态信息。采样完成后，在着生藻类样品登记表上记录样品信息(表2)。

表2 着生藻类样品登记

5 样品前处理和鉴定

5.1 样品的处理和制备

5.1.1 定性样品

常规制片法：将采集到的定性样品根据个体密度适当沉淀、浓缩至适宜体积，观察时，将样品充分摇晃均匀后，静置5～10 s，用胶头滴管吸取液体中间略偏下位置的样品滴放在载玻片上，制成临时装片。

5.1.2 定量样品

将采集到的样品浓缩、沉淀后，定容至20～50 mL(根据样品中生物的密度确定定容体积)。本次实验浓缩沉淀至50 mL。

5.2 鉴定和计数

所有样品鉴定过程中参考《中国淡水藻类——系统、分类及生态》[10]。

5.2.1 定性样品

将5.1.1 中制备的临时装片置于10×40 倍光学显微镜下进行观察、鉴定和粗略计数。

5.2.2 定量样品

将5.1.2 中制备的浓缩样品充分摇晃均匀后，取0.1 mL置于浮游生物计数框中，在10×40 倍光学显微镜下进行观察、鉴定和计数。

5.2.3 计数方法

本实验采用改进的计数方法：对计数框中的样品按照对角线的格进行计数，每0.1 mL计数10个小格，重复计数3个0.1 mL，共计30 小格。

着生藻类每片个数计算公式：

N=100×m/30

(1)

式(1)中：N为每片藻类个体数，ind；m为30 小格总个体数量(镜检生物个体数)，ind；30 为30 个小格；100 为计数框全片格数为100 个。

着生藻类个体数量(藻类密度)计算公式：

n=niV/ViS

(2)

式(2)中：n为单位面积藻类个体数量，ind/cm2；ni为抽样的总个体数量，ind；V为定容总体积，mL；Vi为抽样体积，mL；S为采样的总面积，cm2，本次实验采样总面积为300 cm2。

6 实验结果

本次方法确认的实验时间：2019年3月12日至4月2日，实验室分析结果分述如下。

6.1 天然基质定性监测结果

定性样品鉴定计数结果见表3。

表3 着生藻类—天然基质定性样品数据统计

6.2 人工基质定性、定量样品定性、定量样品

数据鉴定计数结果见表4和表5。

表4 着生藻类—定量样品数据统计表一

表5 着生藻类—定量样品数据统计表二

6.3 精密性

由于生物监测的特殊性，本实验中主要针对定量样品进行精密性检查，通过以下两方面来表征。

6.3.1 平行性

由同一分析人员在相同实验条件下对同一样品做平行分析，评估两次实验数据差异，两片计数结果个数相差不超过15%(平行样A见图5，平行样B见图6)。由表1可知，平行样个数计数结果相对差(相对差=两片计数结果差值/两片计数结果中的较小值×100)为4.7%，符合“两片计数结果个数相差不超过15%”的要求[9](表6)。

表6 精密性检查(平行性)

6.3.2 重复性

统一样品、统一方法、统一分类鉴定参考文献，做不同分析人员比对实验，评估两组实验数据差异，两片计数结果个数相差不超过15%。由表2可知，人员比对藻类个数计数结果相对差(同上)为7.8%，符合“两片计数结果个数相差不超过15%”的要求(表7)。

表7 精密性检查(重复性)

7 讨论

本次实验，探讨了人工基质用于河流中着生藻类监测的可行性，并使用该方法对梁塘河梁南桥断面着生藻类进行了监测，从实验结果来看，在着生藻类定性方面，采用人工基质监测结果与天然基质基本一致，藻种鉴定结果一致性达到95%；在着生藻类定量方面，经过精密性检查，平行性符合“两片计数结果个数相差不超过15%”的要求，重复性符合“两片计数结果个数相差不超过15%”的要求。

总体来看，人工基质比天然基质在河流着生藻类监测方面有以下优势：①人工基质比天然基质外观更规整，没有复杂结构，更容易观测分析；②人工基质比天然基质更具有普及性，可以统一基质的材质并且对不同水体、流域进行横向对比以及同一水体的不同深度纵向对比；③人工基质更易使藻类附着，并且可以在天然基质无法出现的更深水体中放置，开展更多开创性研究；④人工基质比天然基质更易保存，防止由于类似木材生物质离开水体后的氧化腐烂对藻类产生影响。由此可见，用人工基质取代天然基质对河流着生藻类进行监测具有可行性，在今后实际工作中可以尝试采用人工基质开展监测。为继续更深层次的着生藻类研究、水污染预警研究、和水生生物指示剂的研究提供铺垫和引导作用。