骨髓间充质干细胞条件培养基对人自发永生化Müller细胞系增生、黏附和分化的促进作用

2022-04-13葛玲玲李沂键黎其友古贤梁黄小娜陶醉徐海伟

中华实验眼科杂志 2022年3期

葛玲玲李沂键黎其友古贤梁黄小娜陶醉徐海伟

陆军军医大学第一附属医院眼科视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室，重庆 400038

视网膜变性疾病是包含视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变等在内的一类疾病，可导致视力障碍，严重影响患者的生活质量。该类疾病的主要特点是视网膜神经元功能障碍和丧失，继而导致视觉功能不可逆的损害，目前尚无有效的治疗方法。细胞替代治疗是恢复异常视网膜视觉功能一种潜在的有效方法，已成为视网膜再生研究的重要方向。通过干细胞移植可再生损伤的视网膜神经元，但存在增生能力偏低、难以向特定神经元优先分化等问题，成为有效修复视网膜的技术瓶颈。MIO-M1细胞是自然筛选的人源永生化Müller细胞系，具有自我更新的干细胞特性，并有分化成为各种视网膜神经元的潜能。研究表明，MIO-M1细胞能够与视网膜神经元进行细胞整合和分化，取代退化的视网膜细胞，是一种理想的移植细胞来源，但MIO-M1细胞同样存在上述增生能力和定向分化问题。有研究报道间充质干细胞条件培养基可以提高细胞增生和分化的潜力。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓内存在的一类非造血干细胞，可以通过成熟的技术获得，因此受到广泛关注。前期有研究表明，BMSCs能通过产生神经营养因子促进神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的增生和分化，具有较强的神经保护作用。在视网膜的研究中，BMSCs分泌的神经营养因子、抗炎细胞因子和外囊泡对青光眼和光损伤视网膜模型有较好的治疗效果。本实验室前期研究发现，BMSCs和视网膜祖细胞(retinal progenitor cells，RPCs)联合移植于视网膜变性大鼠的视网膜下腔，较单独移植一种细胞(BMSCs或RPCs)能更好地维持视网膜功能，并提高RPCs向感光细胞分化的比率。此外，既往研究也表明，BMSCs与NSCs体外共培养可促进NSCs分化和轴突发育。然而BMSCs对MIO-M1细胞增生能力和定向分化的影响尚未明确。本研究中拟探索BMSCs来源的条件培养基对MIO-M1细胞增生和分化的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

细胞来源 BMSCs由陆军军医大学第一附属医院生物样品库提供；293T细胞购自美国ATCC细胞库；Müller细胞系MIO-M1细胞由上海交通大学附属第一人民医院眼科张敬法教授馈赠。

1.1.2

主要试剂及仪器高糖DMEM、DMEM/F12培养基、质量分数0.25%胰蛋白酶、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution，PBS)(美国HyClone公司)；特级南美胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(乌拉圭Lonsera公司)；兔抗SOX9单克隆抗体(ab185966)、兔抗Rhodopsin单克隆抗体(ab221664)、小鼠抗胞内视黄醛结合蛋白(cellular retinaldehyde-binding protein，CRALBP)单克隆抗体(ab15051)、兔抗MAP2多克隆抗体(ab183830)、兔抗SOX2多克隆抗体(ab97959)(美国Abcam公司)；小鼠抗vimentin单克隆抗体(SC6260)、小鼠抗CHX10单克隆抗体(SC369915)(美国Santa Cruz公司)；小鼠抗谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)单克隆抗体(MAB302)、小鼠抗Tuj1单克隆抗体(T5076)(美国Sigma-Aldrich公司)；兔抗CCND3多克隆抗体(PA5-86224)(美国Invitrogen公司)；流式检测抗体CD34-FITC(11-0349-41)、CD45-FITC(MHCD4501)、人类白细胞DR抗原(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)-FITC(MHLDR01)、CD73-PE(12-0739-41)、CD90-PE(12-0909-42)、CD105-PE(12-1057-42)(美国Thermo公司)；Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG(A-11029)、Alexa Fluor 568标记山羊抗小鼠IgG(A-11031)、BeyoClick5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU)-488细胞增生检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；OriCell成人BMSC成骨、成脂、成软骨诱导分化培养基试剂盒[赛业(苏州)生物科技有限公司]；人源表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(美国PeproTech公司)；血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(北京索莱宝科技有限公司)；逆转录试剂盒(RR047A)、实时荧光定量试剂盒(RR820A)(宝日医生物技术有限公司)。ACEA NovoCyte流式细胞仪(杭州艾森生物有限公司)；OLYMPUS-IX70型生物显微镜(日本Olympus公司)；LSM880型激光扫描共聚焦显微镜(德国蔡司公司)；Thermo ScientificStratos离心机、酶标仪(美国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1

BMSCs的培养及鉴定 BMSCs用含体积分数10%FBS和质量分数1%青链霉素的DMEM/F12培养基培养，光学显微镜下观察细胞生长情况；待细胞生长至80%～90%融合度时进行传代，取第3～5代BMSCs用于后续实验。使用成骨、成软骨及成脂诱导培养基诱导培养第3代BMSCs，使用茜素红、阿利辛蓝及油红O进行染色。制备1×10个/ml的BMSCs单细胞悬液，使用流式抗体对细胞进行避光孵育30 min，1 000 r/min离心5 min收集细胞，PBS漂洗后进行流式细胞仪检测分析。

1.2.2

293T细胞和MIO-M1细胞的培养 293T细胞和MIO-M1细胞用含10%FBS和1%青链霉素的高糖DMEM培养基于37 ℃、体积分数5%CO培养箱中培养；待细胞生长至融合度为90%，用0.25%胰蛋白酶消化进行传代。

1.2.3

免疫荧光法鉴定MIO-M1细胞特性取常规培养的MIO-M1细胞，采用免疫荧光染色法检测Müller细胞标志物SOX9、GS、vimentin和CRALBP蛋白的表达以及视网膜干细胞标志物SOX2、nestin和CHX10的表达。将MIO-M1细胞以1 000个/cm接种于含去分化培养基(含体积分数2%B27、20 ng/ml EGF、10 ng/ml bFGF、1%青链霉素的DMEM/F12培养液)的低黏附培养板中，于37 ℃、5%CO培养箱中培养；取培养3 d的神经球滴于包被多聚赖氨酸的细胞爬片上，继续培养1 d后采用免疫荧光染色法检测神经球中干细胞标志物SOX2、CHX10和细胞增生标志物CCND3的表达。

1.2.4

293T细胞、BMSC培养上清的收集及实验分组将BMSCs和293T细胞接种至直径10 cm培养皿中培养，待融合度至70%～80%时，弃去培养液并用PBS洗3次，换为含1%青链霉素的基础培养基(DMEM/F12)；培养24 h收集培养上清液，2 000×

离心10 min后，取培养上清液用0.22 μm滤器过滤，-80 ℃保存。将MIO-M1细胞分为标准培养基组、293T条件培养基组和BMSC条件培养基组，分别在标准培养基、293T培养上清液和BMSC培养上清液中培养72 h。

1.2.5

MIO-M1细胞形态学分析和细胞计数将标准培养基组、293T条件培养基组和BMSC条件培养基组的MIO-M1细胞免疫标记vimentin和DAPI，并在激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。使用ImageJ软件对细胞的形态学进行计算分析。形态学参数包括细胞面积、周长、圆度[4π(细胞面积)/(细胞周长)]和伸长系数(细胞长轴与短轴的比值)。细胞计数是至少计数5个独立区域共30个细胞中DAPI染色的细胞核。

1.2.6

MIO-M1神经球形态学分析将标准培养基组、293T条件培养基组和BMSC条件培养基组的神经球在光学显微镜下观察并拍照。使用ImageJ软件对细胞面积进行计算分析。100倍视野下，随机选取20个神经球进行统计分析。

1.2.7

EdU染色法检测细胞增生将MIO-M1细胞接种于细胞爬片上分组培养24 h，将37 ℃预热的EdU(终浓度为10 μmol/L)加入细胞中，继续孵育4 h。EdU标记细胞完成后，去除培养液，并加入质量分数4%多聚甲醛固定，用0.5%TritonX-100室温破膜10 min，PBS洗涤3次，每次5 min。然后根据BeyoClickEdU-488细胞增生检测试剂盒的说明书进行实验，加入现配的Click反应液室温下避光孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；滴加DAPI室温下避光孵育10 min，PBS洗涤3次，每次5 min；最后用抗荧光淬灭剂进行封片，利用激光扫描共聚焦显微镜于波长488 nm和405 nm分别检测EdU和细胞核染色情况。

1.2.8

流式细胞仪检测细胞周期将标准培养基组、293T条件培养基组和BMSC条件培养基组的细胞制备成单细胞悬液，用PBS洗1次，1 500 r/min离心5 min收集细胞，调整细胞浓度为1×10个/ml；取1 ml单细胞悬液，离心后，去上清，用少许PBS重悬细胞，再加入500 μl体积分数70%预冷乙醇4 ℃固定过夜；用PBS洗1次，加入100 μl RNase A溶液重悬细胞，37 ℃水浴30 min；再加入200 μl PI染色液，4 ℃避光孵育30 min，直接流式细胞仪上机检测；计算细胞增生指数，细胞增生指数=[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]×100%。

1.2.9

ELISA法检测细胞培养上清液中VCAM-1质量浓度取各组培养24 h的上清液，2 000 ×

离心10 min后，用0.22 μm滤器过滤。按照VCAM-1的ELISA试剂盒说明书进行检测，分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔，除空白孔外每孔加入50 μl对应样本，用封板膜封板后37 ℃温育30 min，洗涤5次，甩干；每孔加酶标试剂50 μl后用封板膜封板后37 ℃温育30 min，洗涤5次，甩干；每孔先后加入显色液A和B各50 μl，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min，最后加入终止液50 μl终止反应，在酶标仪450 nm波长下测量各孔的吸光度(

)值。根据标准品测定结果，计算各组上清液中VCAM-1质量浓度。

1.2.10

MIO-M1细胞诱导分化将MIO-M1细胞接种于包被纤连蛋白的分化培养基[含有体积分数1%N2、2 mmol/L谷氨酰胺、1%青链霉素、5%FBS和1.2 ng/ml bFGF的标准培养基(DMEM/F12)、293T条件培养基或BMSC条件培养基]的培养板中，置于37 ℃、5%CO中培养7 d。收集不同培养条件下的细胞进行实时荧光定量PCR检测。

1.2.11

实时荧光定量PCR检测细胞中各视网膜神经元标志物基因的表达取各组培养细胞，弃去培养基，用PBS洗细胞1次，加入Trizol裂解液提取细胞总RNA。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，检测3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)α、Rhodopsin、β-微管蛋白(β-tubulin，Tuj1)和微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)的mRNA相对表达水平，本研究使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)反应体系：SYBR Green 7.5 μl、双蒸水5.5 μl、正向和反向引物各0.5 μl、cDNA 1.0 μl，总反应体系15.0 μl。扩增条件为95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40个循环。以GAPDH为内参照，采用2法计算各基因相对表达量。

表1 各基因PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence of genes基因名称引物序列(5’-3’)产物长度(bp)GAPDH正向:CCATGTTCGTCATGGGTGTGA140反向:CATGAGTCCTTCCACGATACCAPKCα正向:GCCTATGGCGTCCTGTTGTA271反向:GTGGCTGGATCTCCCTGTTCRhodopsin正向:CTACGTGCCCTTCTCCAATG213反向:GCTAGGTTGAGCAGGATGTAGTTGTuj1正向:CAGCAAGGTGCGTGAGGAGTA185反向:TGCGGAAGCAGATGTCGTAGAMAP2正向:CATACAGGGAGGATGAAGAGG266反向:TGGAGAAGGAGGCAGATTAGVCAM-1正向:GTCAATGTTGCCCCCAGAGA112反向:TTTTCGGAGCAGGAAAGCCC 注:GAPDH:3-磷酸甘油醛脱氢酶;PKC:蛋白激酶C;Tuj1:β-微管蛋白;MAP2:微管相关蛋白2;VCAM:血管细胞黏附分子 Note:GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;PKC:protein kinase C;Tuj1:β-tubulin;MAP2:microtubule-associated protein 2;VCAM:vascular cell adhesion molecule

1.2.12

免疫荧光染色观察细胞中各视网膜神经元标志物蛋白的表达将细胞接种于细胞爬片上，用4%多聚甲醛固定10 min，0.5%TritonX-100破膜10 min，并用5%BSA封闭1 h；分别滴加SOX9抗体(1∶ 400)、CRALBP抗体(1∶ 200)、vimentin抗体(1∶ 200)、GS抗体(1∶ 500)、MAP2抗体(1∶ 200)、Tuj1抗体(1∶ 200)、Rhodopsin抗体(1∶ 200)、SOX2抗体(1∶ 200)、CHX10抗体(1∶ 200)、CCND3抗体(1∶ 400)于4 ℃条件下孵育过夜；PBS洗涤3次，滴加相应二抗室温孵育1 h；PBS漂洗3次，加入DAPI染液室温孵育10 min；PBS漂洗3次，抗荧光淬灭剂封片，激光扫描共聚焦显微镜下采集荧光图像。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。各计量资料数据经Shapiro-Wilk检验证实呈正态分布，以进行表达。采用均衡分组三水平研究设计，3个组间细胞形态学相应指标、细胞增生率、不同细胞周期细胞比例、细胞黏附特性和细胞分化能力相应指标的总体差异比较均采用单因素方差分析，各组细胞培养不同时间点细胞面积的总体差异比较采用两因素方差分析，多重比较均采用Tukey检验。

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs细胞形态及鉴定

光学显微镜下可见第3代BMSCs贴壁生长，形态均匀一致，呈纺锤形(图1A)。BMSCs成骨诱导后3周，中心细胞发生钙化，茜素红染色阳性；成脂诱导分化后3周，细胞内出现融合的脂肪滴，油红O染色阳性；成软骨诱导分化后4周，细胞内出现酸性黏多糖，阿利辛蓝染色阳性(图1B～D)。上述结果表明，BMSCs可成功诱导为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。

图1 BMSCs细胞形态及鉴定 A：光学显微镜下细胞形态(×100，标尺=200 μm) 第3代BMSCs呈纺锥形 B：BMSCs细胞成骨诱导分化鉴定(茜素红 ×200，标尺=100 μm) 细胞发生钙化，茜素红染色阳性(箭头) C：BMSCs细胞成脂诱导分化鉴定(油红O ×200，标尺=100 μm) 细胞内出现融合的脂肪滴，油红O染色阳性(箭头) D：BMSCs细胞成软骨诱导分化鉴定(阿利辛蓝 ×200，标尺=100 μm) 细胞内出现酸性黏多糖，阿利辛蓝染色阳性Figure 1 Morphology and identification of BMSCs A:Cell morphology under light microscope (×100，bar=200 μm) The morphology of the third-passage human BMSCs was spindle-shaped B:Identification of osteogenic differentiation of BMSCs (Alizarin red ×200，bar=100 μm) The cells were calcified and alizarin red staining was positive (arrow) C:Identification of adipogenic differentiation of BMSCs (Oil red O ×200，bar=100 μm) Integrated fat granules were found in the cells and oil red O staining was positive (arrow) D:Identification of chondrogenic differentiation of BMSCs (Alcian blue ×200，bar=100 μm) Acid mucopolysaccharide was found in the cells and alcian blue staining was positive

流式细胞术鉴定结果显示，第3代BMSCs中造血干细胞相关的表面抗原CD34、CD45和HLA-DR呈低表达，百分率分别为0.24%、0.45%和0.15%，表面抗原CD73、CD90和CD105呈高表达，百分率分别为97.90%、95.99%和96.97%，符合BMSCs的生物学特性，提示第3代BMSCs纯度较高，可用于后续实验(图2)。

图2 第3代BMSCs的表面抗原流式细胞检测 BMSCs的造血干细胞相关表面抗原CD34、CD45和HLA-DR呈低表达，表面抗原CD73、CD90和CD105呈高表达 HLA-DR：人类白细胞DR抗原Figure 2 Assay of surface antigen of P3 BMSCs by flow cytometry The expression of hematopoietic stem cell-associated surface antigens CD73，CD90 and CD105 was enhenced，and the expression of CD34，CD46 and HLA-DR was weakened HLA-DR:human leukocyte antigen DR

2.2 MIO-M1细胞的Müller细胞及干细胞特征鉴定

MIO-M1细胞中Müller细胞标志蛋白SOX9和GS染色呈阳性表达，细胞骨架蛋白vimentin染色阳性，细胞质和细胞核CRALBP染色阳性(图3)。同时贴壁培养的MIO-M1细胞中视网膜干细胞标志物SOX2、nestin和CHX10表达阳性；在干细胞诱导培养基中MIO-M1细胞可形成神经球，同时表达干细胞标志物SOX2、CHX10和细胞增生标志物CCND3(图4)，提示MIO-M1细胞具有干细胞特性。

图3 MIO-M1细胞中Müller细胞标志物免疫荧光染色图(×200，标尺=40 μm) A：SOX9蛋白免疫荧光染色细胞核呈红色荧光(Alexa Fluor 568) B:GS蛋白免疫荧光染色细胞质呈绿色荧光(Alexa Fluor 488) C：Vimentin蛋白免疫荧光染色细胞骨架呈红色荧光(Alexa Fluor 568) D：CRALBP蛋白免疫荧光染色细胞质和细胞核呈红色荧光(Alexa Fluor 568) GS：谷氨酰胺合成酶；CRALBP：胞内视黄醛结合蛋白Figure 3 Immunofluorescence staining of Müller cell markers in MIO-M1 cells (×200，bar=40 μm) A:Immunofluorescence staining of SOX9 protein Nuclei showed red fluorescence (Alexa Fluor 568) B:Immunofluorescence staining of GS protein Cytoplasm presented green fluorescence (Alexa Fluor 488) C:Immunofluorescence staining of vimentin protein Cytoskeleton exhibited red fluorescence (Alexa Fluor 568) D:Immunofluorescence staining of CRALBP protein Cytoplasm and nuclei both showed red fluorescence (Alexa Fluor 568) GS:glutamine synthetase;CRALBP:cellular retinaldehyde-binding protein

图4 MIO-M1细胞干细胞标志物免疫荧光染色图(×200，标尺=40 μm) A～C：贴壁培养的MIO-M1细胞表达干细胞标志物SOX2(Alexa Fluor 488)、nestin(Alexa Fluor 568)和CHX10(Alexa Fluor 568) D～F：MIO-M1神经球表达细胞增生标志物CCND3(Alexa Fluor 488)和干细胞标志物SOX2(Alexa Fluor 488)、CHX10(Alexa Fluor 568) CCND3：细胞周期蛋白D3Figure 4 Immunofluorescence staining of stem cell markers in MIO-M1 cells (×200，bar=40 μm) A-C:The stem cell markers SOX2 (Alexa Fluor 488)，nestin (Alexa Fluor 568) and CHX10 (Alexa Fluor 568)，showed a positive expression in adherently incubated MIO-M1 cells D-F:The cell proliferation marker CCND3 (Alexa Fluor 488) and stem cell markers SOX2 (Alexa Fluor 488) and CHX10 (Alexa Fluor 568) were positively exprssed in MIO-M1 neurospheres CCND3:cyclin D3

2.3 各组MIO-M1细胞形态学特征比较

标准培养基组和293T条件培养基组细胞维持扁平细胞形状，BMSC条件培养基组细胞形成细长的纺锤形或多极形态(图5A)。定量形态学分析表明，各组细胞面积、圆度、伸长系数总体比较差异均有统计学意义(

=6.973，

=0.002；

=12.370，

<0.001；

=6.311，

=0.003)；与标准培养基组和293T条件培养基组比较，BMSC条件培养基组细胞面积减少，圆度降低，伸长系数升高，差异均有统计学意义(均

<0.05)(图5B～D)。各组细胞周长总体比较，差异无统计学意义(

=1.669，

=0.197)(图5E)。

图5 各组MIO-M1细胞形态变化 A：各组细胞骨架蛋白vimentin免疫荧光染色图(Alexa Fluor 568 ×200，标尺=40 μm) BMSC条件培养基组细胞形成细长的纺锤形或多极形态 B～E：各组细胞面积、圆度、伸长因子和周长定量分析细胞面积：F=6.973，P=0.002.圆度：F=12.370，P<0.001.伸长因子：F=6.311，P=0.003.周长：F=1.669，P=0.197.与BMSC条件培养基组比较，a P<0.05(单因素方差分析，Tukey检验，n=30) BMSC：骨髓间充质干细胞Figure 5 Morphological changes of MIO-M1 cells A:Immunofluorescence staining of cytoskeleton protein vimentin in various groups (Alexa Fluor 568 ×200，bar=40 μm) The cells in BMSC conditioned medium group were slender spindle-shaped or multipolar B-E:Quantitative analysis of the morphological parameters Cellular area:F=6.973，P=0.002;Circularity: F=12.370，P<0.001;Elongation factor: F=6.311，P=0.003;Perimeter:F=1.669，P=0.197.Compared with BMSC conditioned medium group，a P<0.05 (One-way ANOVA，Tukey test, n=30) BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell

2.4 各组MIO-M1细胞增生能力变化

在去分化培养条件下，各组不同时间点神经球面积总体比较差异均有统计学意义(

=134.300，

<0.001；

=82.910，

<0.001)；BMSC条件培养基组培养1、3和5 d时细胞形成的神经球面积均较标准培养基组和293T条件培养基组大，差异均有统计学意义(均

<0.01)(图6，表2)。标准培养基组、293T条件培养基组和BMSC条件培养基组EdU阳性细胞率分别为(43.38±3.25)%、(45.30±9.93)%和(67.69±15.65)%，总体比较差异有统计学意义(

=6.973，

=0.002)，其中BMSC条件培养基组EdU阳性细胞率明显高于标准培养基组和293T条件培养基组，差异均有统计学意义(均

<0.05)(图7)。

图6 各组MIO-M1细胞去分化诱导培养不同时间点神经球大小变化(×100，标尺=200 μm) BMSC条件培养基组各时间点形成的神经球面积较相应时间点标准培养基组和293T条件培养基组大 BMSC：骨髓间充质干细胞Figure 6 Changes of neurosphere size of MIO-M1 cells at different time points in different groups after dedifferentiation induction (×100，bar=200 μm) At different time points of dedifferentiation induction，the area of neurospheres of MIO-M1 cells formed in BMSC conditioned medium group was increased than standard medium group and 293T conditioned medium group BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell

图7 各组细胞EdU染色比较(×200，标尺=40 μm) BMSC条件培养基组EdU阳性细胞较标准培养基组和293T条件培养基组多 EdU染色呈绿色荧光(Azide 488)，细胞核呈蓝色荧光(DAPI) EdU：5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐；BMSC：骨髓间充质干细胞Figure 7 Comparison of EdU-positive cells among different groups (×200，bar=40 μm) More EdU-positive cells were seen in BMSC conditioned medium group compared with standard medium group and 293T conditioned medium group EdU staining showed green fluorescence (Azide 488) in cytoplasm and blue fluorescence (DAPI) in the nuclei EdU:5-ethynyl-2'-deoxyuridine;DAPI:4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride;BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell

表2 各组不同时间点神经球面积比较(x±s,μm2)Table 2 Comparison of neurosphere area at various time points among different groups (x±s,μm2)组别样本量不同时间点神经球面积培养1 d培养 3 d培养5 d标准培养基组204 029±2 14716 411±7 13317 794±6 120293T条件培养基组203 832±1 72515 585±3 56216 286±4 415BMSC条件培养基组2011 497±6 164ab26 407±6 765ab34 214±9 345ab 注:F组别=134.300,P<0.001;F时间=82.910,P<0.001.与同时间点标准培养基组比较,aP<0.01;与同时间点293T条件培养基组比较,bP<0.01(两因素方差分析,Tukey检验) BMSC:骨髓间充质干细胞 Note: Fgroup=134.300,P<0.001;Ftime=82.910,P<0.001.Compared with standard medium group, aP<0.01;compared with 293T conditioned medium group, bP<0.01 (Two-way ANOVA,Tukey test) BM-SC:bone marrow mesenchymal stem cell

各组MIO-M1细胞增生指数总体比较，差异有统计学意义(

=74.110，

<0.001)，其中BMSC条件培养基组MIO-M1细胞的增生指数均高于标准培养基组和293T条件培养基组，差异均有统计学意义(均

<0.05)(图8，表3)。

图8 不同培养基中MIO-M1细胞周期图 BMSC条件培养基中细胞S期和G2/M期比率之和较标准培养基和293T条件培养基更高 A：标准培养基组 B：293T条件培养基组 C：BMSC条件培养基组Figure 8 MIO-M1 cell cycle in different groups The sum of S-phase and G2/M-phase cells proportion in BMSC conditioned medium group was higher than that in standard medium group and 293T conditioned medium group A:Standard medium group B:293T conditioned medium group C:BMSC conditioned medium group

2.5 各组MIO-M1细胞贴壁能力及VCAM-1表达比较

细胞接种于未包被的培养瓶中培养4 h，光学显微镜下可见BMSC条件培养基组贴壁细胞较标准培养基组和293T条件培养基组多(图9A)。BMSC条件培养基组、293T条件培养基组和标准培养基组培养上清液中VCAM-1质量浓度分别为(1 568.00±135.70)、(1 313.00±73.29)和(1 100.00±111.20)pg/ml，总体比较差异有统计学意义(

=13.720，

=0.006)，其中BMSC条件培养基组培养上清液中VCAM-1质量浓度明显高于标准培养基组和293T条件培养基组，差异均有统计学意义(均

<0.05)(图9B)。BMSC条件培养基组、293T条件培养基组相对于标准培养基组细胞VCAM-1 mRNA相对表达量分别为1.80±0.46和1.08±0.08，总体比较差异有统计学意义(

=7.896，

=0.021)；BMSC条件培养基组VCAM-1 mRNA相对表达量明显高于标准培养基组和293T条件培养基组，差异均有统计学意义(均

<0.05)(图9C)。

图9 各组MIO-M1细胞贴壁及VCAM-1表达水平比较 A：各组培养4 h细胞光学显微镜下观察(×100，标尺=100 μm) BMSC条件培养基组贴壁细胞数较标准培养基组和293T条件培养基组多 B：各组培养上清液中VCAM-1质量浓度比较 F=13.720，P=0.004.与BMSC条件培养基组比较，a P<0.05(单因素方差分析，Tukey检验，n=3) C：各组细胞VCAM-1 mRNA相对表达量比较 F=7.896，P=0.021.与BMSC条件培养基组比较，a P<0.05(单因素方差分析，Tukey检验，n=3) BMSC：骨髓间充质干细胞;VCAM-1:血管细胞黏附分子-1 图10 BMSC条件培养基培养7 d MIO-M1细胞各视网膜神经元标志物免疫荧光染色图(×200，标尺=40 μm) A：PKCα B：Rhodopsin C：Tuj1 D：MAP2Figure 9 Comparison of MIO-M1 cell adhesion and VCAM-1 expression level among different groups A:Observation of MIO-M1 cells of different groups after 4-hour culture under an optical microscope (×100，bar=100 μm) There were more adherent MIO-M1 cells in BMSC conditioned medium group than standard medium group and 293T conditioned medium group B:Comparison of VCAM-1 mass concentration in MIO-M1 cell culture supernatants among different groups F=13.720，P=0.004.Compared with BMSC conditioned medium group，a P<0.05 (One-way ANOVA，Tukey test，n=3) C:Comparison of VCAM-1 mRNA relative expression level in MIO-M1 cells among different groups F=7.896，P=0.021.Compared with BMSC conditioned medium group，a P<0.05 (One-way ANOVA，Tukey test，n=3) BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell;VCAM-1:vascular cell adhension molecule-1 Figure 10 Immunofluorescence staining of retinal neuron markers in MIO-M1 cells after 7-day culture of BMSC conditioned medium(×200，bar=40 μm) A:PKCα B:Rhodopsin C:Tuj1 D:MAP2

2.6 各组MIO-M1细胞分化能力比较

MIO-M1细胞诱导分化7 d，各组细胞均表现出神经元形态，免疫荧光染色结果显示分化细胞表达视网膜神经元标志物PKCα、Rhodopsin、MAP2和Tuj1(图10)。各组间PKCα、Rhodopsin、Tuj1和MAP2 mRNA相对表达量总体比较差异均有统计学意义(

=14.490，

=0.005；

=5.424，

=0.045；

=14.330，

=0.005；

=7.405，

=0.024)；BMSC条件培养基组PKCα、Rhodopsin、Tuj1和MAP2 mRNA相对表达量明显高于标准培养基组和293T条件培养基组，差异均有统计学意义(均

<0.05)(表4)。

表4 不同分化培养基培养后MIO-M1细胞各基因的mRNA相对表达量比较(x±s)Table 4 Comparison of mRNA relative expression levels of various genes in MIO-M1 cells cultured among different groups (x±s)组别样本量各基因mRNA相对表达量PKCαRhodopsinTuj1MAP2标准培养基组31.00 1.00 1.00 1.00 293T条件培养基组31.09±0.131.21±0.371.25±0.090.77±0.17BMSC条件培养基组31.92±0.19ab1.97±0.546 7ab2.18±0.49ab2.15±0.69abF值14.4905.42414.3307.405P值0.0050.0450.0050.024 注:与标准培养基组比较,aP<0.01;与293T条件培养基组比较,bP<0.01(单因素方差分析,Tukey检验) BMSC:骨髓间充质干细胞;PKC:蛋白激酶 C;Tuj1:β-微管蛋白;MAP2:微管相关蛋白2 Note:Compared with standard medium group, aP<0.01;compared with 293T conditioned medium group, bP<0.01 (One-way ANOVA,Tukey test) BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell;PKC:protein kinase C;Tuj1:β-tubulin;MAP2:microtubule-associated protein 2

3 讨论

MIO-M1细胞是取自人类视网膜的一株永生化的Müller细胞系，具有Müller细胞和干细胞的特性，但低表达胶质纤维酸性蛋白，表明其在体外未被激活。MIO-M1细胞在体外具有较强的增生能力，能够分化为多种视网膜神经元。已有研究证明MIO-M1细胞可以整合到视网膜变性大鼠视网膜中并分化。此外，成人来源的视网膜细胞系避免了从胚胎或胎儿组织分离细胞的伦理问题。这些特性使MIO-M1细胞和相关细胞系成为视网膜神经退行性疾病细胞替代疗法中极具吸引力的候选者。有研究报道，MIO-M1细胞在大鼠青光眼模型中具有与视网膜整合并分化为视网膜神经元的潜力。在本研究中，BMSC条件培养基处理的MIO-M1细胞在相同时间内形成的神经球面积较标准培养基和293T条件培养基更大，EdU阳性率更高，与细胞周期的增生指数一致，表明BMSC条件培养基对MIO-M1细胞增生有显著促进作用。

微环境中相邻分化细胞和细胞分泌因子的信号对干细胞的自我更新和多谱系分化起着重要作用。有研究报道BMSCs可能通过旁分泌细胞保护因子和有丝分裂因子对神经元产生影响。同时，本研究发现，BMSC 条件培养基处理的MIO-M1细胞可分泌更多的VCAM-1。既往有研究表明VCAM-1除了促进细胞黏附外，还在促进细胞增生中发挥作用。推测BMSC条件培养基可能通过有丝分裂因子和黏附因子促进MIO-M1细胞黏附，有利于细胞生长。

视网膜神经退行性疾病细胞替代治疗的最佳目标是诱导干细胞或祖细胞分化成高比例的视网膜神经元。本研究结果显示，BMSC条件培养基组细胞诱导分化后高表达中间神经元标志物PKCα和MAP2，视网膜神经节细胞标志物Tuj1和感光细胞标志物Rhodopsin，说明BMSC条件培养基可刺激MIO-M1细胞向视网膜神经元细胞分化。这些结果与以往的研究结果一致，即BMSCs与NSCs体外共培养或BMSC条件培养基处理RPC时，均可以促进NSCs或RPCs的增生和神经元分化。此外，有研究表明在BMSC条件培养基中加入睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CTNF)和bFGF抗体，RPC向神经元分化的能力减弱，而在标准分化培养基中加入CNTF，RPCs视网膜神经元标志物MAP2、Brn3a和Rhodopsin的表达水平明显升高，推测BMSC条件培养基对MIO-M1细胞分化的影响可能是由CNTF介导的。

综上所述，本研究结果表明BMSC条件培养基促进Müller细胞系MIO-M1细胞增生、黏附及神经元的分化。该研究结果为提高视网膜祖细胞的活力和向神经元分化的能力提供了一种新的策略，有利于视网膜干细胞的治疗。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

葛玲玲：酝酿和设计实验，实施研究，采集数据，分析/解释数据，起草文章，统计分析；李沂键：实施研究，采集数据，分析/解释数据，统计分析；黎其友：实施研究，采集数据，统计分析，行政、技术或材料支持；古贤梁：实施研究，采集数据，行政、技术或材料支持；黄小娜：实施研究；陶醉：酝酿和设计实验，统计分析，对文章的知识性内容作批判性审阅；徐海伟：酝酿和设计实验，对文章的知识性内容作批判性审阅，获取研究经费，指导实验