细黄链霉菌产纤维素酶的研究

摘要：以本实验室筛选保藏的产纤维素酶的细黄链霉菌作为出发菌株，对不同初始pH、不同碳源、不同氮源对纤维素酶的影响进行了研究。结果表明，细黄链霉菌产纤维素酶最高时的最适初始pH为7.2、最适碳源为1%羧甲基纤维素钠和0.3%糖蜜、最适氮源为0.3% 硫酸铵和0.3%酵母浸膏，在此条件下纤维素酶的活力能达到8.10U/毫升。为今后将细黄链霉菌更好地开发成农用微生态制剂奠定基础。

关键词：细黄链霉菌；纤维素酶；农用

近年来，随着社会经济的快速发展和人口的迅猛增长，人们对粮食数量和质量的要求也越来越高，农业有机废弃物也随之大量产生。目前，我国有机废弃物的总排放量达到41.3～43.3×108吨/年。在大量生成的农业废弃物中，从有机质养分资源来讲，占首位的是农作物的秸秆。

农作物秸秆是农业生产中产生的废弃物，据统计，我国每年秸秆资源产出量约为10亿吨。纤维素作为农作物秸秆的主要成分，利用微生物对其进行降解，能够生成可被植物吸收利用的肥料，提高秸秆利用率的同时能够很大程度地缓解环境污染，这已成为近年来的研究热点。利于微生物降解纤维素已经取得了一定的成果。

能分解纤维素的菌通常可分为细菌、放线菌和真菌三大类。细菌以枯草芽孢杆菌为主，但是细菌产生的纤维素酶大多为内切酶，不易分泌到胞外，并且纤维素酶活性较低。放线菌和真菌等真核微生物所分泌的纤维素酶主要是胞外酶，—般对纤维素的降解效果好并且酶活力较高。

目前国内对放线菌产纤维素酶的相关研究较少，本研究从实验室所保存的细黄链霉菌中选择产纤维素酶能力较高的菌株，作为出发菌株，通过发酵工艺优化对产酶情况的影响进行了研究，为其在实际中的应用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

Streptomyces？microflavus002由微生物肥料技术研究推广中心分离保藏。？

1.2 培养基

（1）纤维分解鉴定培养基：刚果红纤维素培养基。

（2）种子培养基：高氏一号培养基：可溶性淀粉2%，KNO3？0.1%，K2HPO4？0.05？%，MgSO4？0.05%，FeSO4？0.001%，NaCl？0.05？%，pH7.0～7.4。

（3）液体发酵培养基：KH2PO4？0.5克，MgSO4·7H2O？ 0.25克，明胶2克，羧甲基纤维素2克，蒸馏水1000毫升，pH7.2。

（4）发酵产酶培养基：CMC？ 10.0克，糖蜜3.0克，酵母浸膏3.0克，（NH4）2SO4？3.0克，KH2PO4？2.0克，MgSO4·7H2O？ 0.5克，pH7.2，蒸馏水1000毫升。

1.3 试验方法

种子培养：将实验室保存的细黄链霉菌在刚果红纤维素鉴定培养基进行分离，29℃温度下培养3～5天。选取透明圈较大的菌株进行培养。

将上面筛选出的菌种接种至高氏一号种子培养液（装液量100毫升的500毫升三角瓶），29℃、200转/分钟振荡培养36小时。

发酵培养：将培养好的种子液按10%接种量接入发酵培养基？（装液量200毫升的1000毫升三角瓶），30℃、200转/分钟发酵培养96小时。

菌株酶活的测定：

粗酶液的制备，取适量培养液，4℃、8000转/分钟离心10分钟，上清即为粗酶液。

酶活力的测定，取粗酶液，加入含有50毫克羧甲基纤维素纳（CMC）或50毫克滤纸、并且pH为4.4的缓冲液中，55℃保温l小时或20分钟，之后再加入二硝基水杨酸（DNS），置于沸水中保温显色10分钟后，冷却至室温，用分光光度计于波长为？550纳米下测其OD值，根据所得标准曲线，将每分钟产生1微摩尔的葡萄糖定义为一个酶活单位，以U表示。

发酵工艺优化：

pH对纤维素酶活力的影响。将培养基初始pH调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接种后于29℃、200转/分钟下振荡培养96小时，测定发酵液中纤维素酶的酶活。

碳源对纤维素酶活力的影响。将培养好的种子液接种于不同碳源的培养基中进行发酵培养，测定细黄链霉菌发酵液中纤维素酶的酶活。

氮源对纤维素酶活力的影响。将培养好的种子液接种于不同氮源的培养基中进行发酵培养，测定细黄链霉菌发酵液中纤维素酶的酶活。

2 结果与分析

2.1 产纤维素酶的细黄链霉菌的培养

菌株在经刚果红培养基分离培养，选择在刚果红培养基上的透明圈较大的细黄链霉菌作为产纤维素酶试验菌株。

2.2 纤维素酶活力的测定

根据1.3的方法测定纤维素酶的活力，其结果见图1、图2、？图3。

以pH為横坐标、纤维素酶活力为纵坐标作曲线。结果如图1所示，结果表明，初始pH为7.2时，细黄链霉菌产纤维素酶的活力最高，达到6.68U/毫升，pH为7.0次之，随着初始pH的升高酶活下降。

本试验在以1%的硫酸铵为氮源的前提下，对几种常见碳源下产生的纤维素酶的活力进行了比较，结果如图2所示。结果表明，不同碳源对酶活的影响较大。当羧甲基纤维素钠（CMC）和糖蜜作碳源时，发酵培养第5天产纤维素酶的活力最高，可能因为糖蜜中含有某种微量元素利于菌体纤维素酶的产生；发酵培养第4天，CMC和葡萄糖作碳源下产纤维素酶的活力最高，可能是因为葡萄糖为速效碳源，前期利于菌体的快速生长和纤维素酶的分泌；CMC作为碳源时，纤维素酶的活力最低。因此本试验中细黄链霉菌产纤维素酶的最佳碳源为CMC和糖蜜。

在可溶性淀粉和糖蜜为碳源的情况下，对几种常见氮源下所产生的纤维素酶的酶活进行了比较，结果如图3所示。结果表明，不同氮源对纤维素酶酶活的影响较大。当硫酸铵和酵母浸膏作氮源时，产纤维素酶的活力最高，可能因为酵母浸膏中含有某种微量元素利于菌体纤维素酶的产生；而硫酸铵、豆饼粉等作为氮源时，产纤维素酶的活力相对较低。因此本研究中细黄链霉菌产纤维素酶的最佳氮源为硫酸铵和酵母浸膏。

3 结论与讨论

实验结果表明，细黄链霉菌酶活较高的最适初始pH为7.2、最适碳源为1%的CMC和0.3%？糖蜜、最适氮源为0.3%？硫酸铵和0.3%？酵母浸膏，在此条件下发酵培养5天，纤维素酶的活力能达到8.10U/毫升。

本试验从初始pH、碳源、氮源3个方面对细黄链霉菌产纤维素酶的情况进行了研究，为今后利用细黄链霉菌生产纤维素酶提供了相关理论依据。由于细黄链霉菌产纤维素酶的活性较低，并且影响酶产生及酶活力的因素较多。因此筛选得到的试验菌株细黄链霉菌的产酶条件有待进一步优化。

作者简介：申术霞（1989-），女，硕士研究生，中级工程师。主要从事微生物发酵及代谢产物的研究。