石漠化生境对三叶木通生长及生理特性的影响

于晓松,王晓红,李 林,刘 智,杨宁线,张明生

贵州大学生命科学学院/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室,贵阳 550025

喀斯特石漠化是一种人为造成的土地退化过程,广泛分布于中国西南地区,尤以贵州最为严重,已成为我国三大生态灾害之一[1—2]。对此国内外学者在治理石漠化方面开展了大量的研究,宏观尺度上利用层次分析法、压力响应模型等方法对石漠化区域植被恢复情况和影响因子进行定量研究[3—4]；微观尺度上通过引入外来植被对石漠化生境进行修复,减缓其退化[5—6]。但受地质因素制约,石漠化生境成土速率慢且土被不连续,土壤富钙而偏碱性且土层浅薄,保水能力差,极大的限制了植被的生产力[7]。因此以上方法虽然对石漠化治理得到了一定的改善,但由于植被选择不当,治理后的植被生态稳定性差、抵抗力弱,导致石漠化治理成效并不明显,治理成果难以维系[8]。

三叶木通(Akebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.)作为一种多年生藤本植物,是贵州本土重要的药食两用植物,被《中华人民共和国药典》(2020版)收录[9],其果实可食用,不同器官也可制作成茶、酒和食用油等[10—11]。同时三叶木通作为石漠化生境适生物种,用其治理石漠化生境,不仅能够改善喀斯特石漠化生境,还能够为当地带来较大的经济效益。而植被在面对逆境时会改变外部形态和内部生理生化形成特定的生存策略,从而抵御和适应逆境[12],如植物生长受到抑制[13]、光合作用的改变[14]、各种氧化酶的协调作用[15]以及自身有机渗透物质的调节等[16]。不同植物面对逆境时会有不同的生长及生理适应策略,且目前仅局限于对根、茎和叶等单一器官进行研究,鲜有学者从植物各器官进行系统的研究。而三叶木通作为治理石漠化生境的经济物种之一,其各器官如何通过形态及生理生化的改变来适应石漠化生境还未见报道,机理也并不清楚。因此开展石漠化生境下三叶木通生长生理响应机制显得尤为重要。

本研究以三叶木通为材料,通过对石漠化生境和普通生境下植株的生长和生理生化指标动态变化的对比分析,了解三叶木通响应石漠化生境的生理调节机制,为指导三叶木通综合治理石漠化生态环境提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验地点

以贵州省的贵阳市花溪区石板镇芦荻村(以下简称“花溪基地”)和安顺市关岭县花江镇中寨村(以下简称“关岭基地”) 2个典型喀斯特地貌区域作为实验地(其中一地作为实验重复),分别在两地各选取一处石漠化生境(>1000 m2),同时从其附近各选取一处普通生境(非石漠化区域)作为对照(>1000 m2),各基地地理及气象数据(表1)来源于贵州省气象局档案馆。

表1 不同基地地理及气象数据

1.2 实验材料与实验设计

三叶木通(Akebiatrifoliata(Thunb.) Koidz.)种苗由贵州大学农学院中药材研究所提供,选择生长健壮、无病虫害、长势基本一致的一年生苗为种植材料,在4月初进行统一种植并取土壤进行理化性质检测(表2),对相同基地不同生境进行显著性分析。结合表1和表2,可知“花溪基地”和“关岭基地”具有相似的环境要素,作为实验的两个重复处理。本文重点检测石漠化对植物生理生态和生长表现的影响,而植物不同表现来源于石漠化的影响而非不同基地的生长条件差异。普通生境按株行距为2 m×3 m栽种并搭架,石漠化生境则根据实际情况进行栽种,并分成10个小区,自然降雨,不添加任何肥料,使其自然生长。在各小区随机抽取6株长势基本一致的植株,其中3株用于生长指数测定(每隔30 d左右进行一次),另外3株用于生理生化指标测定。取样时,选取植株上部1 m处茎段和叶片以及土层20 cm内的根为材料,装入自封袋后冰盒保存迅速带回实验室,液氮速冻,-80 ℃保存。

表2 不同生境下土壤理化性质(平均值±标准差)

1.3 指标测定方法

1.3.1生长指标

株高用皮尺测量；茎粗用游标卡尺测量；叶片数用计数法。

1.3.2生理指标

选取各基地不同生境下三叶木通中部枝条的成熟功能叶,在急速生长期7月份于10点整使用YZQ- 100C荧光-光合仪(翼鬃麒科技, 北京),选用封闭控光叶室,设置有效光强为1500 μmol m-2s-1,测定净光合速率(Pn)及影响因子,包括气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)并计算水分利用率(WUE=Pn/Tr),每个栽培地重复3株。

相对含水量(RWC)采用烘干称重法,叶片叶绿素含量采用乙醇-丙酮法,丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥酸(TAB)法,相对电导率(RC)用电导仪(雷磁DDS307, 上海)测量,超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)光还原法,过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法,过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法,脯氨酸(Pro)含量采用磺基水杨酸法,可溶性糖(SS)含量采用硫酸蒽酮比色法；可溶性蛋白(SP)含量采用考马斯亮蓝法[17]。以上指标均以鲜重测量,3次重复。

1.3.3数据分析

所有数据处理用Excel 2010和SPSS 19.0进行统计,用Origin 2019 b作图,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比较检验处理间差异性。

为了更加全面、系统地评价三叶木通在石漠化生境下的生长生理响应,对实验中各时期、各器官部位的相关生长和生理生化指标的平均值进行主成分分析。为消除材料间的差异,采用抗逆系数方法进行主要响应指标评价(抗逆系数=逆境胁迫下的测定值/对照下测定值)[18]。

2 结果与分析

2.1 石漠化生境对三叶木通生长的影响

形态指标是植物生长最直观的体现。本试验中,与对照相比石漠化生境下三叶木通的株高降低、茎粗缩小和叶片数减少(图1),关岭、花溪两个基地的石漠化生境下三叶木通株高相差不大,两个基地普通生境下的株高差异亦不明显；但石漠化生境下的株高显著低于对照,关岭基地平均株高相差0.6 m,花溪基地平均株高相差0.8 m。石漠化生境下的茎粗也明显小于对照,在8月份最显著,关岭基地茎粗在石漠化生境下比对照相差1.34 mm,花溪基地相差0.42 mm。石漠化生境下植株叶片数也少于对照,关岭基地较为显著,其相差多达120片。

图1 不同生境下三叶木通各时期的生长状况(平均值±标准误)

2.2 石漠化生境对三叶木通光合相关指标的影响

光合作用是植物最重要的基础生理活动,为植物生长发育提供所需的物质和能量[19]。由表3可知,在两个基地,不同生境条件下植株净光合速率差异显著,石漠化生境下的Pn显著低于普通生境,其影响因子Gs和Tr显著下降,Ci上升,WUE下降。

表3 不同生境下三叶木通的光合特性及水分利用率(平均值±标准差)

水分是植物的重要组成成分,是控制植物光合作用和生物量的主要因素之一[20]。随着时间的推移,普通生境下植株各器官的RWC变化不大,而石漠化生境植株的RWC减少,并逐渐低于对照,达到了极显著水平(图2)。可见,石漠化生境会使三叶木通的RWC降低。

图2 不同生境下三叶木通的相对含水量(平均值±标准误)

叶片是光合作用的主要场所,叶片叶绿素含量是影响植株光合作用的重要指标之一[21]。由图3可见,叶绿素a和叶绿素b含量随着时间进程总体呈现升高,且石漠化生境下显著低于对照。

图3 不同生境下三叶木通的叶绿素含量(平均值±标准误)

2.3 石漠化生境对三叶木通细胞膜保护系统的影响

细胞膜的选择透过性能够维持细胞微环境和正常代谢,在遭遇损伤时会产生膜脂过氧化物(MDA),其含量可反应植物的逆境伤害程度[22]。三叶木通在石漠化生境下的MDA显著高于对照,随着时间的延长,MDA呈先急速增长,后减缓趋于平稳(图4)。

图4 不同生境下三叶木通的丙二醛含量(平均值±标准误)

相对电导率通过反映膜透性的大小而验证逆境对生物膜的伤害程度[23]。石漠化生境可造成三叶木通叶片细胞膜系统的严重损伤。图5显示,石漠化生境下三叶木通的相对电导率均显著高于普通生境,尤以8月份相差最为显著,随后电导率开始下降。

图5 不同生境下三叶木通叶片的相对电导率(平均值±标准误)

植物SOD、POD和CAT是植物体内清除活性氧和自由基的3种关键酶,而活性氧的清除能力是衡量植物抗逆性的关键指标[24]。由图6可见,POD活性随时间延长呈先上升后减缓,其中石漠化生境对三叶木通根和叶的POD活性影响不显著,但茎段的POD活性显著高于对照；SOD活性随时间延长变化较为平缓,石漠化生境下三叶木通叶片SOD活性显著高于对照,而在根、茎中的变化无规律；CAT活性随时间延长呈先上升后平缓,根中CAT活性在石漠化生境下显著高于对照,茎中CAT活性差异不大,关岭基地石漠化生境下叶片中的CAT活性要显著高于普通生境,而花溪基地并未出现此现象。

2.4 石漠化生境对三叶木通渗透调节物质的影响

植物可通过渗透调节物质来维持体内水分平衡和细胞间膨压以抵抗逆境[25]。SS、SP和Pro是植物体内重要的渗透调节物质,对保持原生质与环境的渗透平衡起重要作用[26]。本研究发现,随着时间进程,石漠化生境和对照下的三叶木通各器官中SS含量几乎均呈上升趋势,且石漠化生境下多高于对照,其最大值出现在根中(图7)；SP整体呈现升高趋势,根、茎、叶中的含量均高于对照,其最大值在叶片中(图8)；Pro整体呈现升高趋势,根、茎、叶中的含量的均高于对照(图9)。

图8 不同生境下三叶木通的可溶性蛋白含量(平均值±标准误)

图9 不同生境下三叶木通的脯氨酸含量

2.5 三叶木通对石漠化生境的适应性综合评价

主成分分析法可将多个原始指标转换为综合指标进行分析,这样能综合反映植物的抗逆性[27]。根据特征值大于1的原则,对两个基地的三叶木通生长和生理生化共14个指标进行主成分分析(图10),关岭基地的第一个主成分是MDA>POD>Chla>SP,第二个主成分是CAT>SS>RWC；花溪基地的第一个主成分是MDA>POD>SP,第二个主成分是CAT>SS>Chlb。综合分析,MDA、POD和SP在三叶木通适应石漠化逆境中占重要地位,且两个基地呈现出最主要的成分皆为MDA。

图10 不同生境下三叶木通各指标的主成分分析

3 讨论

石漠化生境作为一种典型的逆境胁迫,在众多逆境因素协同作用下,不仅改变植物的形态,对植物的生理生化特性改变也十分显著,因此植物对待逆境胁迫的表现则是一个复杂的综合性状[28]。而喀斯特石漠化生境最典型的特征便是缺水干旱。本研究发现,石漠化生境下三叶木通的株高、茎粗以及叶片数等生长形态会发生降低现象,由此可知三叶木通面对石漠化生境是一种被动性适应。此变化不仅能够避免植物因蒸腾作用造成的水分大量散失,维持植物整体的水分平衡[29],同时也减少了植物地上部的生物量,提高资源利用率,从而适应环境的改变[30]。

光合作用是植物最重要的合成代谢过程之一,其受植物器官的RWC和叶绿素等众多指标影响[31]。本研究发现,石漠化生境下三叶木通的各器官RWC均随胁迫时间的延长而逐渐降低,叶绿素a与叶绿素b也呈现下降趋势,这与俞乐等[32]研究相符合。其原因可能是石漠化生境使三叶木通水分缺失,从而抑制叶绿素的合成,进而会造成植物光合速率降低[33],这与本研究Pn下降相符合。而Pn受气孔因素和非气孔因素影响,本研究中发现石漠化生境下三叶木通的Pn下降,伴随着Ci呈现上升趋势,Gs呈现下降趋势,由此可以判断石漠化生境下三叶木通的Pn下降是由于非气孔因素导致[34]。据郑俊明研究表明[35],非气孔因素导致Pn下降说明三叶木通的光系统和酶系统被石漠化生境所破坏。

逆境会对植物的细胞膜结构和功能造成伤害,导致质膜透性增加,使膜稳定性降低,进而导致细胞内流出大量的离子和大分子物质,对植物造成氧化伤害和渗透性伤害[36]。MDA和RC则是衡量植物细胞膜受损情况的重要指标[37]。本研究发现,石漠化生境下三叶木通各器官部位的MDA含量和叶片的RC呈现上升趋势,由此说明石漠化生境会对三叶木通的细胞膜造成损伤,这与刘锦春等[38]研究相符合。而植物自身会提高一些抗氧化酶活性抵御细胞膜的氧化伤害,但酶活性的提高在各器官中存在一定的差异。SOD是以氧自由基为底物的酶,可猝灭超氧负离子的毒性,终止由超氧负离子启动的一系列自由基连锁反应所造成生物毒损伤,本研究发现其活性在三叶木通叶片中提高最为显著。POD是一种以铁卟啉为辅基的氧化酶,能够催化H2O2氧化某些酚类、芳香胺和抗坏血酸等还原性物质,本研究发现其活性在三叶木通茎中提高最为显著。CAT是一种酶类清除剂,能够清除植物体内的H2O2,使细胞免遭毒害,本研究发现其活性在三叶木通根中提高最为显著。由此可知,石漠化生境会对三叶木通细胞膜系统造成氧化损伤,而三叶木通会通过提高根中的CAT活性、茎中的POD活性和叶中的SOD活性,协同作用共同抵御自由基造成的氧化损伤。

逆境下,植物会通过调节渗透性物质的含量来维持体内水分平衡和细胞间膨压,以此抵御逆境造成的渗透性伤害[22]。本研究发现,石漠化生境下三叶木通的各器官中Pro和SP会明显增加,这与欧芷阳等[16]研究相符合。其中Pro是一种防脱水剂,其含量的增加能够帮助三叶木通在石漠化生境下束缚更多的水,从而阻止细胞膜脱离,增强细胞保水能力,稳定细胞结构等功效[39]。SP含量的增加可能原因是石漠化生境加快了三叶木通有机物质的形成、转化和运输,使得SP在营养器官中产生大量的积累,从而维持生命过程[40]。同时Chaves等[41]研究发现脯氨酸的积累可以防止蛋白质结构受到破坏,以稳定抗氧化酶的活性和功能,因此伴随着Pro含量的增加,SP含量也随之上升。但石漠化生境下,三叶木通的SS含量仅在根中会有所提高,相比于其他渗透性调节物质(Pro、SP)表现出一定的滞后性,表明三叶木通中SS对石漠化生境的响应强度要显著低于其他渗透调节物质,可能原因是因为植物为了适应逆境,消耗可溶性糖进行植物体内的代谢调节或者可溶性糖的合成受到了抑制,故植物体内可溶性糖含量变化不大[42]。

植物对石漠化生境的抗逆性是一个复杂的综合性状,由众多指标协同抵御伤害,各指标之间存在着一定的关联,其重要性也不尽相同。利用普通的方法很难从众多因素中综合评价植物对石漠化生境的主要响应指标。因此本研究结合前人相关研究,通过主成分分析对三叶木通在石漠化生境的抗逆性进行综合评价。本研究发现,在三叶木通抵抗石漠化生境中起主要作用的第一主成分是MDA和Chla,其含量变化能够反映出三叶木通的损伤程度和光合速率,可见石漠化生境对三叶木通造成最主要影响为氧化伤害和光合速率；第二主成分主要包括POD、Chlb等,第三主成分则为RWC和株高,可见这些指标协同作用使三叶木通可通过减少活性氧的伤害,提高自身的渗透调节能力,减轻细胞遭受的损伤以及改变自身生长形态,从而适应喀斯特石漠化生境。本研究仅局限于三叶木通的生长及生理生化指标的测定,对其分子响应机理及其相关控制基因还有待进一步探究。

4 结论

通过对比分析,本研究发现三叶木通在石漠化生境下形态、生理生化方面等都会发生显著的改变。其中表现为降低株高、缩小茎粗和减少叶片数等形态方面,降低净光合速率、提高POD、SOD和CAT等抗氧化酶活性、增加SP、Pro和SS等渗透性调节物质含量等生理生化措施,进而适应石漠化生态环境。通过主成分分析,发现MDA、POD和SP等指标在三叶木通对石漠化逆境应答机制中起主要作用。本研究初步揭示了三叶木通对石漠化生境的应答机制,同时也为通过三叶木通综合治理喀斯特石漠化生态环境提供了一定的理论依据。