液相色谱-串联质谱法用于鲜桑叶中31种农药残留分析＊

张国平，汤逸飞，孙海燕，黄 芳，屠雨晨，陈文海，戴建忠，陈欣慰

（1. 嘉兴市农业综合检验检测中心，浙江 嘉兴 314050； 2. 海宁市经济作物技术服务站，浙江 海宁 314400）

桑树在我国较为常见，桑园成片综合开发，其叶片可养蚕缫丝和食药两用[1]，因此桑园中的桑树尽量不用一般杀虫剂农药，而多使用安全间隔期短[2]的备案农药如甲基硫菌灵等杀菌剂农药，因此其他农药在桑叶中如有检出残留则多为农药污染。鲜桑叶是指桑树长出的新鲜叶片，此时的桑叶含水量较多，农药残留检测中有利于消除基质干扰；更重要的是，春季的鲜桑叶采摘时其他农作物农药使用还未达到高峰，空气和灌溉用水中污染还未完全扩散，桑叶养蚕中毒事件较少。以春季鲜桑叶为基质，对鲜桑叶中31种农药污染进行方法学的验证并通过校准曲线进行定量分析，技术上可提供对特定的农药污染的检出，进而可能导致蚕中毒进行提前预警，对蚕桑生产具有一定的现实意义。

1 材料与方法

1.1 样品来源

鲜桑叶采集设定在2021年4月～5月，选取嘉兴地区前期已饲养过家蚕而未发生家蚕中毒事件的蚕桑基地2家共2批次样品，随机摘取叶片，每份样品不少于1 kg，每次采样后将样品切碎后进行匀浆并贮存于低温冰箱中以待处理。

1.2 试剂和仪器

样品前处理中，提取试剂为4.0 g 硫酸镁、1.0 g氯化镁、1.0 g 柠檬酸钠和0.5 g 柠檬酸氢二钠；净化试剂为150 mg 乙二胺-N-丙基硅烷、15 mg 石墨化炭黑和885 mg 硫酸镁。其他材料包括：超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）、乙腈（色谱级，美国TEDIA 公司）、甲酸（色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、1 mol·L-1乙酸铵溶液（上海麦克林生化科技有限公司）和有证标准物质（北京曼哈格生物科技有限公司）。

样品检测流程中，超高效液相色谱/四级三重杆串联质谱仪（LC-20AD/QTRAP4500，日本岛津公司/美国AB Sciex公司）为分析仪器；垂直振荡器（HVS-10M，天津恒奥科技发展有限公司）、多管旋涡混合仪（BTV-100，上海一恒科技有限公司）、离心机（ROTINA 420R，德国Hettich 公司）、电子天平（Scout SE-SE202F，美国OHAUS 公司）和旋涡混合器（XW-80A，上海精密科学仪器有限公司）为其他重要仪器。

1.3 检测流程和方法

检测流程中样品前处理步骤：量取样品10.0 g，加入10 mL 乙腈溶液，加入提取盐试剂包和1 枚陶瓷均质子，振摇1 min，4200 r·min-1离心5 min；分别取上清提取液和乙腈各3.0 mL 转移到净化离心管中，涡旋1 min，4200 r·min-1离心5 min；取上清净化液，0.22 μm水膜过滤待测液，等待分析仪器进样。

检测方法中，液相色谱柱采用Kinetex Biphenyl柱（2.6 μm，2.1 mm×100 mm），流动相A 为（0.2%甲酸+2 mmol·L-1乙酸铵水溶液），B 为乙腈，流速0.5 mL·min-1，柱温35℃，进待测液1 μL。检测过程流动相初始条件为A∶B=95∶5，保持4 min；A∶B=95∶5→80∶20，运行0.5 min；A∶B=80∶20，保持3.5 min；A∶B=80∶20→60∶40，运行0.5 min；A∶B=60∶40，保持2.5 min；A∶B=60∶40→36∶64，运行0.5 min；A∶B=36∶64，保持3.5 min；A∶B=36∶64→5∶95，运行1 min；A∶B=5∶95，保持4 min；A∶B=5∶95→95∶5，运行0.1 min；A∶B=95∶5，保持15 min。MRM模式下，正离子电喷雾离子源（ESI+）设定源参数为喷雾电压（IonSpray Voltage）、辅助气1（GS1）、辅助气2（GS2）、辅助气加热温度（TEM）和气帘气（CUR）均为默认设置[3]。检测仪器获得的数据通过工作站MultiQuant进行图像处理和数据分析。

2 结果与分析

2.1 鲜桑叶基质对数据分析的影响

鲜桑叶基质在检测中可能存在假阳性，因此本研究对鲜桑叶基质进行检测。提取离子流图（XIC）结果表明，鲜桑叶基质采用QuEChERS 试剂包不会产生假阳性。鲜桑叶加标基质的峰形良好，没有杂峰干扰并且响应较大的离子对为定量离子对。鲜桑叶基质中31 种农药的总离子流（TIC）如图1 所示。

图1 鲜桑叶基质中31种农药（100 μg/L）的总离子流图Fig. 1 Total Ion Graph of 31 Pesticides (100 μg/L) in Fresh Mulberry Leaves

2.2 农药质量参数验证

分别精密吸取各农药标准品储备液，用鲜桑叶基质甲醇溶液配制成10 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、150 μg·L-1和250 μg·L-1系列浓度，按照保留时间顺序分段检测，采用定量离子对的峰面积绘制标准曲线。

结果表明，31种农药在10 μg·L-1～250 μg·L-1的范围内线性关系良好（表1），其线性回归曲线的相关系数r在0.9901～0.9981之间。

表1 31种农药在鲜桑叶基质中的线性回归方程和相关系数Table 1 Linear Regression Equations and Correlation Coefficients of 31 Pesticides in Fresh Mulberry Leaves

2.3 回收率和精密度试验结果

3种加标样品为向空白鲜桑叶样品中分别添加低浓度（0.01 mg·kg-1）、中浓度（0.10 mg·kg-1）和高浓度（0.25 mg·kg-1）3种农药混合标准溶液。经过提取和净化步骤处理后，液相色谱三重四级杆串联质谱上样，每个样品连续测试3针，每个样品设置3个平行，根据XIC 以获得每种农药的峰面积用来计算回收率（P）和精密度（RSD），见图2。

图2 31种农药在鲜桑叶基质中回收率和精密度的平均值（n=3）Fig. 2 Average Recoveries and Precision Rates of 31 Pesticides in Fresh Mulberry Leaves (n=3)

结果低浓度（0.01 mg·kg-1）p 范围为69.14%～127.81%，RSD 为0.92%～29.75%；中浓度（0.1 mg·kg-1）p 范围为75.59%～126.28%，RSD 为0.44%～20.57%；高浓度（0.25 mg·kg-1）p 范围为70.43%～108.61%，RSD 为0.38%～16.51%。该检测方法准确度和精密度相对满足要求。

3 讨论和小结

虽然桑叶药材产品中农药多残留检测分析有一定数量的报道[4，5]，但鲜桑叶含水量相对更多，因此两者检测方法特别是前处理方法并不能混用。目前，鲜桑叶的农药多残留检测研究报道多以定性为主的农药残留快速检测手段[6，7]，检测项目有限。因此，本研究尝试将鲜桑叶样品经乙腈提取，以QuEChERS 法为前处理技术，在质谱多反应监测（MRM）模式下，进行基质外标法定量，用液相色谱三重四级杆串联质谱法同时测定鲜桑叶中31 种农药残留，检测结果显示：在10 μg·L-1～250 μg·L-1范围内线性关系良好，采用标准曲线法对加标量分别为0.01 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1和0.25 mg·kg-1的空白基质样品进行加标回收试验，加标回收率相对满足准确度和精密度要求。该方法可及时筛查桑叶中农药多残留情况，为家蚕饲养用桑叶安全生产提供技术支持。

实地走访两家成片桑园也发现，首先，桑园远离其他农作物种植基地，其他种类农药污染累积的来源较少；其次，桑园外围的桑树既可用于景观，又可对所在及周边的土壤、灌溉水和空气中农药污染风险因子进行必要的物理阻隔，桑园深处的桑叶用于蚕桑或果桑生产[8]；第三，桑园土壤和水环境中微生物对于稀释农药污染也具有一定的自净能力[9]。用于蚕桑生产的两批次样品中没有检测出31 种农药残留，抽样分析证明桑园农药污染风险较低[10]。

最后，鉴于成片桑园春季的鲜桑叶农药污染较少，因此可以将桑园前期已饲养过蚕而未发生蚕中毒事件的桑叶作为桑叶的基质标准提前进行制备冷冻保存，检测时可作为基质标准，减少定量检测中基质干扰，增加定量准确度，从而达到快速定量筛查的目的。